Abiotic stress responses in mould and non-conventional yeasts

Debaryomyces hansenii es una levadura ascomicética, de un gran potencial biotecnológico, que se encuentra habitualmente en ambientes salinos como pueden ser el agua de mar o algunos embutidos. Sin embargo, su caracterización molecular se ha visto ralentizada por algunas peculiaridades como el hecho de que la mayoría de las cepas son aneuploides, de ser una levadura difícil de transformar, ó mostrar un bajo porcentaje de recombinación homóloga. En este trabajo de tesis doctoral se han abordado diversos aspectos de la fisiología de D. hansenii tanto a nivel molecular cómo a nivel más aplicado. Primero estudiamos las posibles relaciones entre las respuestas a estrés salino y oxidativo tanto a nivel molecular como enzimático o metabólico. Nuestros resultados muestran como la expresión de genes relacionados con estrés oxidativo se indujo por exposición a estrés salino (NaCl y KCl), y viceversa, que la transcripción de algunos genes relacionados con el estrés osmótico/salino fue inducida por exposición a H2O2. Estos efectos también se han demostrado a nivel enzimático donde el estrés salino indujo la actividad de las enzimas catalasa y glutatión reductasa, típicamente consideradas defensas antioxidantes. Además, a nivel metabólico, ambos estreses indujeron la producción de ROS, y la exposición a peróxido de hidrogeno influyó en la acumulación intracelular de sodio. Por otra parte, hemos abordado el tema del posible carácter halotolerante o halófilo de D. hansenii desde una aproximación novedosa, puesto que por primera vez se han utilizado biorreactores para este estudio que nos han permitido crecer las células bajo condiciones controladas. Nuestros resultados han demostrado que la presencia de altas concentraciones de NaCl o KCl fue beneficiosa para la velocidad de crecimiento de la levadura en comparación con los experimentos control (sin sales), tanto utilizando para su estimación la cosecha de biomasa como la producción de CO2. De hecho, en condiciones de limitación de nutrientes como la glucosa, la presencia de NaCl produjo una mayor cantidad de biomasa que el KCl. En su conjunto estos resultados apoyan el carácter halófilo y no sólo halotolerante de esta levadura. En todos estos experimentos no se produjo etanol en ninguna de las condiciones de trabajo, lo que indica un metabolismo completamente respiratorio. Finalmente, en la última parte de este trabajo se ha utilizado una cepa de D. hansenii aislada de embutidos de la zona del Valle de los Pedroches y se ha inoculado sobre la superficie de lomo ibérico con el fin de estudiar su posible efecto sobre las características fisicoquímicas del embutido. En todas las condiciones estudiadas la levadura fue capaz de implantarse en la superficie de las muestras de lomo y afectar a sus características de manera que estas muestras mantenían una mayor actividad de agua, un pH más alto, y un menor contenido en sodio al final de los tres meses de maduración del producto. Aunque la levadura no cambio el perfil general de ácidos grasos sí que afectó a los niveles de compuestos volátiles y aromáticos. Hay que señalar que las catas realizadas indican una tendencia a una mayor aceptación de los lomos inoculados específicamente con levadura por parte de los consumidores.Debaryomyces hansenii is an ascomycetic yeast with a high biotechnological potential that can be usually found in salty environments such as seawater or several sausages. However, its molecular characterization has been slowed down due to some peculiarities: most strains are aneuploid, horizontal gene transfer is difficult, and homologous recombination is low. In this thesis, we have studied several molecular and physiological aspects of D. hansenii using both basic and applied approaches. We have studied possible interconnections between the responses to salt and oxidative stress at molecular, enzymatic and metabolic levels. Our results show that expression of genes related to oxidative stress was induced by NaCl and KCl. On the other hand transcription of genes related to osmotic/salt stress was induced by H2O2. These effects have been also demonstrated at the enzymatic level since salt stress induced the activity of antioxidants defenses such as catalase and glutathione reductase. Moreover, at metabolic level both stresses induced an increase in intracellular ROS, and H2O2 exposure influenced intracellular sodium accumulation. Also, we have addressed the controversy over whether D. hansenii is halotolerant or halophilic from a new approach since, as far as we know, controlled growth in bioreactors has been used to study the physiology of this yeast. Our results have shown that the presence of NaCl or KCl improved the growth rate of the yeast since it increased total biomass or CO2 production. In fact, under limiting glucose content, the presence of NaCl produced a higher amount of biomass than the presence of KCl. All together, these results support the halophilic behavior of this yeast. We did not detect significant amounts of ethanol under any of the different conditions used in this work, suggesting a fully respiratory metabolism in D. hansenii. Finally we have used a D. hansenii wild terroir (Valle de los Pedroches) strain to inoculate the surface of Iberian pork loins in order to study its effect on the physicochemical characteristics in the product. Under all the conditions tested, this yeast was able to grow on the surface of the pork loin modifying its characteristics. All inoculated samples showed higher water activity and pH, and less sodium content after the three months ripening period. The yeast did not change the fatty acid profile but it affected the level of volatile and aromatics compounds. Finally, the acceptability tests indicated a tendency to a better consumer acceptance of the pork loin specifically inoculated with the yeast