Determinación de la localización sub-celular de proteínas quinasas específicas de polen PSK1, 2, 3 Y 4 de arabidopsis thaliana

Tesis (Magíster en Biotecnología)Proyecto FONDECYT Nº 1120766.Los granos de polen son el gametofito masculino de las plantas, esenciales para su reproducción y productividad. En Arabidopsis, el grano de polen maduro está compuesto por tres células: una gran célula vegetativa y dos pequeñas células espermáticas contenidas en el citoplasma de la célula vegetativa. Durante la fertilización, el tubo polínico transporta direccionalmente a las células espermáticas hacia el óvulo para producir el evento de doble fertilización. Actualmente, se conoce poco acerca de las vías de transducción de señales y mecanismos moleculares involucrados en el proceso de desarrollo y función del polen. Utilizando datos de microarreglos se han identificado cuatro genes que codifican para proteínas quinasas en polen, denominados POLLEN SPECIFIC KINASE1-4 (PSK1-4) que se expresan durante las últimas etapas del desarrollo del polen, germinación y elongación del tubo polínico en Arabidopsis. Como parte del proceso de caracterización de dichos genes en el desarrollo del polen, es necesario analizar la localización sub-celular de las proteínas a las cuales codifican. De acuerdo a análisis bioinformáticos previos basados en secuencias aminoacídicas, PSK1 (At2g41970) y PSK3 (At5g26150) se encontrarían en el citoplasma, mientras que PSK2 (At5g18910) y PSK4 (At5g12000) en el núcleo. Para comprobar experimentalmente estos datos, se generaron fusiones traduccionales del ORF de cada PSK a GFP bajo el control de tres promotores: El promotor específico de polen LeLAT52, el promotor endógeno de cada PSK o el promotor constitutivo 35S. Una vez obtenidas las construcciones, plantas silvestres de Arabidopsis thaliana fueron transformadas establemente mediante el método de floral dip (LeLAT52 y promotores endógenos) y hojas de tabaco (promotor 35S) fueron transformadas de manera transitoria mediante infiltración, para posteriormente analizar la fluorescencia de GFP al microscopio confocal. Los análisis en hojas de tabaco indican que PSK1 se localiza en en la pared celular, PSK2 en el núcleo, PSK3 en la membrana plasmática y PSK4 en los plasmodesmas. Los análisis en tubo polínico sugieren que PSK1 y PSK3 se localizan en el citoplasma, PSK2 en el núcleo de la célula vegetativa –de acuerdo a lo obtenido en hojas de tabaco– y PSK4 en endosomas. Tomando en cuenta que plantas mutantes en los genes PSK muestran fenotipos anormales durante el crecimiento y guía del tubo polínico, estos resultados podrían entregar información importante para determinar su rol biológico.Pollen grains are the male gametophyte of plants, essential for their reproduction and productivity. In Arabidopsis, mature pollen grain is composed of three cells: a vegetative cell and two small sperm cells contained in the cytoplasm of the vegetative cell. During fertilization, the pollen tube directionally transports sperm cells to the egg cell, to produce the double fertilization event. Currently, little is known about the signal transduction pathways and molecular mechanisms involved in the process of development and pollen function. Using microarray data have identified four genes encoding protein kinases in pollen, called POLLEN SPECIFIC KINASE1-4 (PSK1-4) that are expressed during the last stages of the pollen development, germination and pollen tube elongation in Arabidopsis. As part of the characterization of these genes in pollen development, it is necessary to analyze the subcellular localization of the proteins for which they encode. According to previous bioinformatics analysis, based on amino acid sequences, PSK1 (At2g41970) and PSK3 (At5g26150) would be found in the cytoplasm, while PSK2 (At5g18910) and PSK4 (At5g12000) in the nucleus. To experimentally verify this data, we generated translational fusions of the PSKs ORF to GFP under control of three different promoters: the pollen specific promoter LeLAT52, the native promoter of each PSK or the constitutive promoter 35S. Once obtained the constructions, wild type Arabidopsis thaliana plants were stably transformed by floral dip method (LeLAT52 and endogenous promoters) and tobacco leaves (35S promoter) were transiently transformed by infiltration, for subsequent analysis of GFP fluorescence using confocal microscopy. Analyzes in tobacco leaves indicate that PSK1 would be located in the cell wall, PSK2 in the nucleus, PSK3 in the plasma membrane and PSK4 in plasmodesmatas. Analyses in the pollen tube suggest that PSK1 and PSK3 are located in the cytoplasm, PSK2 is localized in the nucleus of the vegetative cell –according to what was obtained in tobacco leaves– and PSK4 in the endosomes. Taking into account that mutants in these PSKs display abnormal phenotypes in pollen tube growth and guidance, these results could provide important information to determine their biological role