Milieu de culture sélectif pour la détection de Pseudomonas protegens

Le but de cette démarche était de détecter et d'isoler spécifiquement par une double approche moléculaire et culturale l’espèce Pseudomonas protegens, une bactérie de la rhizospère ayant un fort potentiel d’application agronomique avec des activités entomopathogènes et PGPR (1). Tout d'abord, nous avons développé une détection par PCR de P. protegens en ciblant un gène du locus fit impliqué dans la synthèse de la toxine entomopathogène FitD (2). Nous avons dessiné des amorces dans le gène fitF, qui code un senseur histidine-kinase. Au sein du genre Pseudomonas, ces amorces amplifient spécifiquement l’ADN génomique des deux espèces entomopathogènes, P. protegens et P. chlororaphis. Afin de distinguer les deux espèces, nous avons ensuite développé un milieu de culture minimum sélectif et spécifique de P. protegens, appelé milieu M9-PP-agar. La base, le milieu M9, est additionnée d'acide adipique comme unique source de carbone et d'un antimicrobien, l'irgasan. Contrairement à de nombreuses autres espèces de Pseudomonas dont P. chlororaphis, P. protegens est capable d’assimiler l'acide adipique. Parmi les antimicrobiens couramment utilisés pour sélectionner Pseudomonas aeruginosa (acide nalidixique, irgasan et cétrimide) (3), P. protegens est particulièrement résistant à l’irgasan. Sur M9-PP-agar, les colonies apparaissent brunes après 5 jours de culture. D'autres Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida) ou d’autres espèces bactériennes (Achromobacter, Agrobacterium, Serratia, Variovorax) sont capables de se multiplier plus ou moins tardivement sur M9-PP-agar mais en se différentiant par l’absence de couleur brune. Pour valider la sélectivité et la spécificité du milieu M9-PP-agar dans des matrices complexes, nous avons inoculé la souche de référence P. protegens CHAOT dans deux sols de bord de rivière argilo-limoneux (département Hérault), puis étalé des suspensions de ces sols sur le milieu sélectif. Par comparaison avec un milieu riche (gélose nutritive), une inhibition de croissance de la population bactérienne des sols et une croissance spécifique de P. protegens ont été observées. Ce nouveau milieu gélosé est donc un outil puissant pour l’isolement sélectif, rapide et efficace de P. protegens