La administración intraovárica de Huperzina-A revierte las alteraciones en la función ovárica inducidas por estrés en ratas adultas

Tesis Doctor en FarmacologíaEl Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP) es la causa más común de infertilidad de origen ovárico. Esta patología se manifiesta como una disfunción endocrino-metabólica que se caracteriza por la presencia de amenorrea, aumento en los niveles de andrógenos, hirsutismo y ovarios de mayor tamaño con la presencia de numerosos quistes foliculares, alteraciones metabólicas, hipertensión, apnea, etc. Para conocer las múltiples características fisiopatológicas del síndrome, se ha hecho necesario el desarrollo de modelos animales que permitan integrarlas en un modelo de esta patología. Nuestro grupo de trabajo ha desarrollado experimentalmente el concepto -- demostrado en ratas y en humanos --, que la sobrecarga simpática tiene un papel causal importante en su desarrollo. Un aumento en el tono simpático por exposición crónica a estrés por frío induce un fenotipo similar a la condición de ovario poliquístico, caracterizado por una disminución de los folículos pre-antrales, aumento de folículos antrales con hipertecosis, quistes ováricos e hiperandrogenismo. Sin embargo, se desconoce el efecto del estrés simpático sobre la fertilidad de la rata hembra. El ovario, al igual que todos los órganos periféricos está sujeto a regulación simpática y parasimpática. Este órgano recibe inervación vagal, sin embargo, las fibras nerviosas parasimpáticas que inervan al ovario no lo hacen directamente al folículo ovárico, si no que ingresan por la región hiliar y se asocian a vasos sanguíneos, a diferencia de los nervios simpáticos que se asocian a folículos ováricos en todas las etapas del desarrollo. Curiosamente, en las células de granulosa del folículo ovárico de humanos y primates, se ha descrito un sistema colinérgico local, encontrándose receptores muscarínicos M1, M3 y M5, acetilcolina (ACh), colina acetiltransferasa (ChAT), transportador neuronal y de membrana para ACh y la enzima que lo degrada, la Acetilcolinesterasa (AChE). Esta descrito en ovario de rata la presencia de receptores muscarínicos y AChE, y esta descrito que el tratamiento crónico local in vivo con Huperzina-A (Hup-A) (inhibidor de AChE) mediante minibombas osmóticas, aumenta el número de cuerpos lúteos, y disminuye el número de quistes en rata, comparado con un animal al cual se le realiza la intervención, pero sin instalar la minibomba osmótica (Sham). Por lo tanto, dado que el estrés por sobrecarga simpática produce el fenotipo similar al SOP, sería posible que el sistema colinérgico local del ovario jugara un papel antagónico en el desarrollo folicular frente a la sobrecarga simpática del estrés. Por todo lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar si LA ADMINISTRACIÓN INTRAOVÁRICA DE HUPERZINA-A REVIERTE LAS ALTERACIONES EN LA FUNCIÓN OVÁRICA INDUCIDAS POR ESTRÉS EN RATAS ADULTAS. Usamos ratas hembras virgenes sprague dawley que se expusieron a estrés por frío durante cuatro semanas, posteriormente se hemiovarioectomización y se implantó una minibomba osmótica con fármaco (Hup-A o Hup-A y atropina) que administró fármaco durante 28 días o se sometió a la cirugía, pero sin la administración del fármaco (Sham). Al final del procedimiento se recolectaron los ovarios y el plasma, además de realizar experimentos de fertilidad. Durante todo el procedimiento se siguió la ciclicidad estral, determinando indirectamente el número de ovulaciones de los ciclos. Se midieron los niveles plasmáticos de hormonas esteroidales. Los ovarios se utilizaron para medir neurotransmisores y realizar un análisis morfométrico de estructuras foliculares para determinar la dinámica del desarrollo folicular. Finalmente, se midió la fertilidad de estas ratas. Los resultados mostraron que el estrés aumenta los niveles de noradrenalina (NA) y ACh, y frente a este aumento, predomina la NA produciendo alteraciones en la función ovárica como disminución de los ciclos, alteraciones en el desarrollo folicular (disminución de cuerpos lúteos y aparición de quistes), hiperandrogenismo e infertilidad. La administración de Hup-A aumenta los niveles de ACh, pero también aumenta los niveles de NA aún más, revirtiendo parcialmente las alteraciones en la función ovárica, aumentando los ciclos, disminuyendo quistes y restableciendo los niveles de Testosterona (T), pero no aumenta la fertilidad. Estos resultados contribuyen a consolidar la regulación del sistema colinérgico local como una herramienta para revertir alteraciones ováricas. La búsqueda de nuevos fármacos específicos para los receptores nicotínicos y que no produzcan estimulación simpática contribuirán a un nuevo enfoque farmacológico complementario para el tratamiento del SOPPolycystic Ovarian Syndrome (PCOS) is the most common cause of ovarian infertility. This pathology manifests as an endocrine-metabolic dysfunction,characterized by the presence of amenorrhea, increased plasma levels of androgens, hirsutism and ovaries with the presence of numerous medium size follicular cyst , metabolic disorders, hypertension, apnea, etc. To know the multiple physiopathological characteristics of the syndrome, the development of animal models its necessary. Our working group has experimentally developed the concept that sympathetic overload plays an important causal role in its development. An increase in sympathetic tone due to chronic exposure to cold stress, induces a phenotype similar to the polycystic ovarian condition, characterized by a decrease in pre-antral follicles, an increase in antral follicles with hyperthecosis, ovarian cysts and hyperandrogenism. However, the effect of sympathetic stress on female fertility is unknown. The ovary, like all peripheral organs, is under sympathetic and parasympathetic regulation. This organ receives vagal innervation, however, parasympathetic nerve fibers that innervate the ovary do not directly organize around the ovarian follicle but enter through the hilar region and are associated with blood vessels, unlike the sympathetic nerves that are associated with Ovarian follicles at all stages of development. Interestingly, in the granulosa cells of the ovarian follicle of humans and primates, a local cholinergic system has been described, being muscarinic receptors M1, M3 and M5, acetylcholine (ACh), choline acetyltransferase (ChAT), neuronal and membrane transporter for ACh and the enzyme that degrades it, acetylcholinesterase (AChE). The presence of muscarinic receptors and AChE was demonstrated in rat ovary, and it was described that local chronic treatment in vivo with Huperzine-A (AChE inhibitor) by means of osmotic minipumps, increases the number of corpora lutea, and decreases the number of cysts in rat, compared with an animal to which the intervention is performed, but without installing the osmotic minipump (Sham). Therefore, given that sympathetic overload stress produces the phenotype similar to PCOS, it would be possible that the local cholinergic system of the ovary played an antagonistic role in follicular development against the sympathetic overload of stress. For all the above, the objective of this work was to determine if INTRAOVARIAN ADMINISTRATION OF HUPERZINE-A REVERSES ALTERATIONS IN THE OVARIAN FUNCTION INDUCED BY STRESS IN ADULT RATS. We used Sprague Dawley rats that were exposed to cold stress for four weeks, then hemiovarioectomy was done and an osmotic minipump with drug (Hup-A or Hup-A and atropine) was implanted during 28 days or underwent sham surgery. At the end of the procedure, ovaries and plasma were collected. In addition, in other group of sham or stressed rats we did fertility experiments. Throughout the procedure the estrual cyclicity was followed, indirectly determining the number of ovulations by the number of estrual cycles. Plasma levels of steroidal hormones were measured. The ovaries were used to measure neurotransmitters and perform a morphometric analysis of follicular structures to determine the dynamics of follicular development. Finally, the fertility of these rats was measured. The results showed that stress increases both the levels of NA and ACh, but NA predominates producing alterations in ovarian function such as decreased cycles, alterations in follicular development (decrease in corpora lutea and appearance of cysts), hyperandrogenism and infertility. The administration of Hup-A increases the ACh levels, but also the NA levels even more, partially reversing the alterations in the ovarian function, improves the cycles, decreases cysts and restores Testosterone levels (T), but does not increase the fertility. These results have consolidated the regulation of the local cholinergic system as a tool to revert ovarian alterations. The search for new specific drugs for nicotinic receptors and that do not produce sympathetic stimulation will contribute to a new complementary pharmacological approach for the treatment of PCOSFONDECYT: N°1170291; Conicyt N°2117007