Use of solvatic model for retention times prediction in reversed-phase liquid cromatography

Obstajajo različni pristopi za razvoj kromatografskih metod pri reverznofazni tekočinski kromatografiji. Poleg tradicionalnega pristopa »poskus-napaka« lahko uporabljamo tudi različno programsko opremo za razvoj in optimizacijo kromatografskih metod, ki deluje na podlagi različnih retencijskih modelov. Glavni namen mojega doktorskega dela je bil uporaba solvatnega modela za napovedovanje retencijskih časov pri reverznofazni tekočinski kromatografiji z gradientno elucijo na različnih stacionarnih fazah (C18, C8 in fenil-heksil) in z različnimi mobilnimi faza mi (klasične vodne mobilne faze – fosforna kislina, amonijev acetat ter modernejše vodne mobilne faze – ionske tekočine) za zdravilno učinkovino aripiprazol in njegove nečistote, opisane v Evropski farmakopeji. Ker imajo te spojine izjemno podobne kemijske strukture, predstavlja njihova ločba zahteven izziv. Napoved zadrževanja je bila ustrezna na vseh testiranih stacionarnih fazah v kombinaciji z 0,1 % fosforno kislino oz. 10 mM amonijevim acetatom oz. 1 mM ionsko tekočino [BMIM][BF4] kot vodno mobilno fazo ter acetonitrilom oz. metanolom kot organskim modifikatorjem. Za napoved zadrževanja pri ničelni aproksimaciji upoštevamo strukturno formulo analitov ter značilnosti stacionarne in mobilne faze. Pri uporabi klasičnih mobilnih faz je bila povprečna razlika v rezultatih med eksperimentalnimi in napovedanimi retencijskimi časi -14 – -17 % v primeru uporabe stacionarne faze fenil-heksil, na kateri je bilo ujemanje največje. Po uporabi solvatnega retencijskega modela skupaj s podatki enega eksperimenta se je povprečna razlika retencijskih časov zmanjšala na največ -7 %, po uporabi podatkov dveh eksperimentov pa se je povprečna razlika zmanjšala na največ -2 % na vseh preiskovanih stacionarnih fazah (za večinopreiskovanih spojin je bila razlika med napovedanimi retencijskimi in eksperimentalno dobljenimi retencijskimi časi manjša od -3 %). Ovrednotila sem tudi vpliv klasičnih mobilnih faz in modernejših vodnih mobilnih faz na ločbo posameznih spojin in na faktor simetrije. Pri eksperimentalnem delu sem uporabila tri različne ionske tekočine. Kot najbolj primerna in najbolj uporabna se je izkazala ionska tekočina [BMIM][BF4]. Po uporabi solvatnega retencijskega modela pri mobilni fazi s to ionsko tekočino skupaj s podatki enega eksperimenta je bila povprečna razlika retencijskih časov največ -5 %, po uporabi podatkov dveh eksperimentov pa se je povprečna razlika zmanjšala na največ -1 %. Pri uporabi ionske tekočine [BMIM][BF4] so bili v primerjavi z uporabo pufra amonijevega acetata kromatografski vrhovi bolj simetrični. Preučevala sem tudi stabilnost aripiprazola po stresnem testiranju pri povišani temperaturi in pri oksidacijskih pogojih. Razgradne produkte sem identificirala z masno spektrometrijo sklopljeno s tekočinsko kromatografijo. Poleg farmakopejske nečistote sem identificirala še dva dodatna razgradna produkta.There are several different approaches for high performance liquid chromatography method development. Beside traditional approach »trial and error«, different software programs for method development and optimization are available, which are based on different retention models. Main goal of my PhD work was application of solvatic model for prediction of retention at gradient elution in reversed-phase liquid chromatography with different type of stationary phases (C18, C8 and phenyl-hexyl) and with different type of mobile phases (classical aqueous mobile phases – phosphoric acid/ammonium acetate and more modern aqueous mobile phases – ionic liquids) for active pharmaceutical ingredient aripiprazole and its related substances, described in European Pharmacopoeia. As this compounds have very similar chemical structure, their separation is challenging. Retention prediction was suitable on all examined stationary phases with 0.1 % phosphoric acid / 10 mM ammonium acetate/ 1 mM ionic liquid [BMIM][BF4] as aqueous mobile phases and acetonitrile / methanol as organic modifiers. Predicted retention take into account structural formulae of compounds and properties of stationary and mobile phases. In the case of classical mobile phases the average differencebetween experimental and predicted retention times was -14 – -17 % on phenyl-hexyl stationary phase, where the highest matching was obtained. After utilisation of the solvation retention model with data from one experimental run, the average difference decreased to maximal -7 %and after contribution of data from two experimental runs, to maximal -2 % on all examined stationary phases (for majority of studied compounds difference between predicted and experimental values is lower than -3 %). The influence of classical and modern aqueous mobile phases on resolution of individual components and simmetry factor was evaluated. At experimental work three different ionic liquids were examined. Ionic liquid [BMIM][BF4] was the most appropriate and the most useful. In the case of usage of modern mobile phases (ionic liquids) and after utilisation of the solvation retention models with data from one experimental run, the average difference decreased to maximal -5 % and after contribution of data from two experimental runs, to maximal -1 %. In the case of ionic liquid [BMIM][BF4] in comparison with buffer ammonium acetate, chromatographic peaks were more symmetrical. The stability of aripiprazole at higher temperatures and at oxidation conditions was studied. Degradation products of aripiprazole were identified with mass spectrometry coupled to liquid chromatography. Beside pharmacopoeia impurity two additional degradation products were identified