Strategie di riattivazione dell’attività di p53 in cellule tumorali mediante l’utilizzo di peptidi che interagiscono con Parc

L'insorgenza tumorale è guidata da inattivazione di geni soppressori o da attivazione di oncogeni che possono essere di tipo genetico o epigenetico. Il neuroblastoma è un tumore pediatrico che si origina dalle cellule della cresta neurale embrionale. In molti neuroblastomi primari e linee cellulari di neuroblastoma, p53 non risulta mutato, ma è frequentemente delocalizzato nel citoplasma. Anche nella linea cellulare di osteosarcoma U2OS p53 è wild type e risiede nel citoplasma. Recentemente, è stata identificata la proteina Parc, descritta come proteina citoplasmatica che lega p53, e che almeno in alcuni contesti cellulari, ostacola l'entrata di p53 nel nucleo. Poichè l'assetto wt di p53 non ne impedisce la riattivazione delle funzioni proapototiche, l'obbiettivo di questo studio è stato quello di idenificare strategie capaci di ripristinare l'attività di p53 in cellule tumorali, e di valutarrne il possibile uso terapeutico. In questo studio abbiamo testato l'attività di un peptide, relativo alla porzione C-terminale di p53 in grado di legare Parc, in cellule tumorali con p53 wt e citoplasmatica. L'ingresso del peptide nelle cellule era reso possibile fondendo quest'ultimo al dominio di trasduzione TAT (TAT-p53-C-ter). Dopo aver dimostrato la capacità del peptide di permeare nelle cellule, abbiamo utilizzato tale peptide per valutarne la capacità di riattivare p53 mediante la distruzione del legame Parc-p53. Utilizzando un saggio del doppio ibrido, abbiamo dimostrato che il dominio di tetramerizzazione di p53 (TD) è necessario e sufficiente a legare Parc. Inoltre il peptide TAT-p53-C-ter è in grado di distruggere il complesso Parc-p53. Saggi funzionali dimostrano che TAT-p53-C-ter stimola la trascrizione di geni reporter posti sotto il controllo di un promotore responsivo a p53. Inoltre il trattamento con TAT-p53-C-ter di linee cellulari di neuroblastoma provoca l'aumento dei livelli di espressione di p21, Bax ed MDM2, soltanto in cellule che possiedono p53 wt. Infine il peptide TAT-p53-C-ter stimolala rilocalizzazione nucleare di p53 e potenzia l'apoptosi indotta da etoposide. I dati prodotti in questo lavoro suggeriscono che peptidi in grado di interagire con Parc sono promettenti candidati per indurre aumento di apoptosi p53-dipendente in tumori che presentano p53 delocalizzata nel citoplasma, ma con assetto wt.Tumourigenesis is driven by epigenetic or genetic inactivation of tumour suppressors and activation of oncogenes. Neuroblastoma (NB) is a childhood tumor deriving from the embryonic neural crest. In most NB tumours and cell lines, p53 is not mutated but frequently misplaced in the cytoplasm. In the U2OS osteosarcoma cell line, p53 is also wild type and resides in the cytoplasm. Recently, Parc has been described as a cytoplasm-localized protein that binds p53 and, at least in some cellular contexts, prevents p53 from entering the nucleus. Since p53’s wt status doesn’t prevent the reactivation of its proapoptotic function we aimed at identifying strategies restoring p53 activity in cancer cells and at validating them for possible therapeutic use. We tested the activity of a p53 carboxy-terminal peptide containing Parc-interacting region in cancer cells with wild type cytoplasmic p53. Peptide delivery was achieved by fusing it to the TAT transduction domain (TAT-p53-C-ter peptide). After demonstration of its ability to permeate into cells, we used this peptide to verify its capability on restoring p53 activity by destruction p53-Parc binding. In a two-hybrid assay, we found that the tetramerization domain (TD) of p53 was necessary and sufficient to bind Parc. The TAT-p53-C-ter peptide disrupted the Parc-p53 complex. Functional assays demonstred that TAT-p53-C-ter is able to upregulate luciferase activity by p53 responsive promoter. Furthermore, TAT-p53-C-ter treatment of NB cell lines increased p21, Bax and MDM2 expression, only in wt p53 cells. In addition, TAT-p53-C-ter treatment stimulates p53 nuclear relocalization and enhances etoposide-induced apoptosis. Together, these studies suggest that Parc-interacting peptides are promising candidates for the enhancement of p53-dependent apoptosis in tumours with wt cytoplasmic p53