Involvement of Gut Immune System in the pathogenesis of type 1 diabetes: detection of T cell reactivity to Gliadin

Diversi studi sperimentali hanno evidenziato un possibile ruolo del sistema immune intestinale nella patogenesi del diabete di tipo 1(T1D). Lo scopo del nostro studio è stato quello di evidenziare un possibile link tra il sistema immune intestinale e il T1D, in particolare un possibile ruolo del glutine come antigene T cellulare nel T1D. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate da 25 bambini con T1D (età da 3.4 a 19.6 anni), da 22 controlli sani (HC) (età da 3.5 a 17 anni) entrambi negativi per gli anticorpi antiendomisio e anti-transglutaminasi e da 15 bambini con malattia celiaca (CD) (età da 2.2 a 13.3 anni). Nella prima parte dello studio, in 6 bambini affetti da T1D, in 5 con CD, e in 6 HC, i PBMC sono stati coltivati con o senza OKT3 e anti-CD28mAb. Dopo 18 ore è stata valutata l’espressione dell’integrina β7 mediante citometria a flusso multiparametrica. Nei pazienti con T1D abbiamo osservato una alta espressione dell’integrina Beta7 su linfociti T CD4+ con fenotipo di memoria. Dopo attivazione policlonale abbiamo osservato una significativa riduzione dell’espressione dell’integrina Beta7 su linfociti T CD4+ con fenotipo di memoria nei pazienti con T1D rispetto ai controlli. Nella seconda parte dello studio, i PBMC di 19 bambini con T1D , 10 con CD e 17 HC, sono stati coltivati, a diverse concentrazioni, con/senza un digesto peptico-triptico di gliadina (PTG) e/o con il digesto di gliadina transglutaminata (TG)-PTG. La proliferazione dei PBMC è stata valutata al quinto giorno di coltura tramite la determinazione dell’incorporazione di [3H]-timidina. E’ stata inoltre valutata, nei sopranatanti delle colture cellulari, la produzione di IFN-gamma e IL-4 mediante metodica ELISA, e l’espressione dell’integrina Beta7 mediante citometria a flusso. Nei pazienti con T1D abbiamo evidenziato una risposta proliferativa dose-dipendente dei PBMC dopo stimolazione con PTG e/o TG-PTG. In 7 degli 11 pazienti con T1D (64%) abbiamo osservato una risposta proliferativa dopo stimolazione con PTG, con una media di indice di stimolazione (SI) maggiore nei pazienti con T1D rispetto ai controlli (2,95±2 vs.1,3±0,6 rispettivamente, p=0,02). Quando i PBMC sono stati stimolati con il TG-PTG abbiamo osservato una risposta proliferativa in 6 dei 13 pazienti con T1D (54%) and 2 dei 3 pazienti con CD (67%) (T1D 2,4±2 vs. HC 1,5±0,7). In 3 dei 7 T1D che hanno risposta alla gliadina (43%), ma in nessun dei controlli sani, la stimolazione con 100 µg/ml TG-PTG ha indotto la produzione di IFN-gamma. In 1 paziente con T1D abbiamo osservato, dopo stimolazione con gliadina, l’induzione di una discreta popolazione di cellule CD4+ con alta espressione dell’integrina β7. I nostri dati mostrano che cellule T che esprimono alti livelli di integrina β7 sono evidenziabili nel sangue periferico di pazienti con CD and T1D e abbiamo inoltre osservato un aumento della risposta T cellulare glutine-specifica nei pazienti con T1D. Questi dati supportano l’ipotesi che l’immunità verso antigeni orali è alterata nei pazienti con T1D. E’ tuttavia necessario un lungo follow-up per stabilire se i pazienti con T1D studiati hanno un aumentato rischio di sviluppare la malattia celiaca.Accumulating data indicate that a dysregulation of the gut immune system may play a role in the development of Beta cell autoimmunity and type 1 diabetes (T1D). The aim of this study was to determine a possible link between the gut immune system and T1D, in particular, a possible role of gliadin as a T cell antigen in human T1D. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from 25 children with T1D (aged from 3.4 to 19.6 yrs), 22 healthy controls (HC) (aged from 3.5 to 17 yrs), both negative for both anti-endomysial and anti-human tissue transglutaminase antibodies and 15 children with celiac disease (CD) (aged from 2.2 to 13.3 yrs). In the first part of the study, in 6 children with T1D, 5 with CD and in 6 HC, PBMC were cultured with or without OKT3 plus anti-CD28mAb. After 18 hours the expression of β7 integrin was determined by flow cytometry. In patients with T1D we observed a higher expression of Beta7 integrin on memory CD4+ T cells. After polyclonal stimulation we found a significant reduction of Beta7 expression on memory CD4+ T cell in T1D patients compared with healthy controls. In the second part of the study, in 19 children with T1D, 10 with CD and in 17 HC, PBMC were cultured with the peptic-tryptic digest of gliadin (PTG) and/or transgluatminase-treated (TG)-PTG at increasing concentrations, or left un-stimulated. PBMC proliferation was assessed on day 5 by [3H]-thymidine incorporation assay. We also assessed IFN-gamma and IL-4 production in culture supernatants by ELISA and we studied the expression of Beta7 integrin by flow cytometry. In T1D patients we detected a dose-response PBMC proliferation to both PTG and TG-PTG with the maximal proliferation at the concentration of 100 µg/ml. PBMC from 7 out of 11 T1D patients (64%) responded to 100 µg /ml PTG. Mean stimulation index (SI) in T1D patients was higher than in HC (2,95±2 vs.1,3±0,6 respectively, p=0,02). When PBMC were stimulated with TG-PTG we found that 6 out of 13 T1D (54%) and 2 out of 3 CD (67%) showed a proliferative response (T1D 2,4±2 vs. HC 1,5±0,7). In 3 of 7 T1D responders (43%) but not in HC, TG-PTG induced IFN-gamma production. In 1 patient with T1D we identified, after the stimulation with TG-PTG, a discrete population of CD4+ β7hi+ cells. Our data show that T cells expressing high levels of β7 integrin are detectable in peripheral blood of CD and T1D patients and we found an enhanced T cell-mediated gluten-specific immunity in T1D patients. This supports the hypothesis that immunity to oral proteins is altered in T1D patients. Long term follow-up is necessary to establish whether these subjects are at increased risk for developing celiac disease