Strukturelle und funktionale Charakterisierung von TFIIH aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\)

Gene expression and transfer of the genetic information to the next generation forms the basis of cellular life. These processes crucially rely on DNA, thus the preservation, transcription and translation of DNA is of fundamental importance for any living being. The general transcription factor TFIIH is a ten subunit protein complex, which consists of two subcomplexes: XPB, p62, p52, p44, p34, and p8 constitute the TFIIH core, CDK7, CyclinH, and MAT1 constitute the CAK. These two subcomplexes are connected via XPD. TFIIH is a crucial factor involved in both, DNA repair and transcription. The central role of TFIIH is underlined by three severe disorders linked to failure of TFIIH in these processes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome, and trichothiodystrophy. Only limited structural and functional data of TFIIH are available so far. Here, the model organism Chaetomium thermophilum was utilized with the aim to structurally and functionally characterize TFIIH. By combining the expression and purification of single TFIIH subunits with the co-expression and co-purification of dual complexes, a unique and powerful modular system of the TFIIH core subunits could be established, encompassing all proteins in high quality and fully functional. This system permits the step-wise assembly of TFIIH core, thereby making it possible to assess the influence of the intricate interaction network within TFIIH core on the overall enzymatic activities of TFIIH, which has not been possible so far. Utilizing the single subunits and dual complexes, a detailed interaction network of TFIIH core was established, revealing the crucial role of the p34 subunit as a central scaffold of TFIIH by linking the two proteins p44 and p52. Our studies also suggest that p62 constitutes the central interface of TFIIH to the environment rather than acting as a scaffold. TFIIH core complexes were assembled and investigated via electron microscopy. Preliminary data indicate that TFIIH adopts different conformational states, which are important to fulfill its functions in transcription and DNA repair. Additionally, a shortened construct of p62 was used to develop an easy-to-use, low cost strategy to overcome the crystallographic phase problem via cesium derivatization.Die Expression von Genen und die Weitergabe des Erbguts an die nächste Generation bilden die Grundlage jeden Lebens. Bei diesen Vorgängen spielt die DNA eine entscheidende Rolle. Deshalb sind der Erhalt, die Transkription und die Translation der DNA von fundamentaler Bedeutung für alle Lebewesen. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIH ist ein Multi-Proteinkomplex und umfasst insgesamt zehn Untereinheiten. TFIIH kann in zwei Teilkomplexe unterteilt werden: XPB, p62, p52, p44, p34 und p8 bilden den TFIIH Core Komplex, CDK7, CyclinH und MAT1 bilden den CAK Komplex. Diese beiden Teilkomplexe werden durch XPD verbunden. TFIIH spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der DNA Reparatur, als auch in der Transkription. Diese zentrale Rolle wird durch das Auftreten dreier schwerer Krankheiten deutlich, die mit dem Ausfall von TFIIH bei diesen Aufgaben in Verbindung stehen: Xeroderma pigmentosum, Cockayne-Syndrom und Trichothiodystrophie. Daten bezüglich der Struktur und Funktion von TFIIH stehen bisher nur in begrenztem Umfang zur Verfügung. In dieser Arbeit kam der Modellorganismus Chaetomium thermophilum zum Einsatz, mit dem Ziel die Struktur und Funktion von TFIIH näher zu beleuchten. Durch die Kombination der Expression und Aufreinigung einzelner TFIIH Untereinheiten mit der Koexpression und Koaufreinigung von dualen Komplexen konnte ein einmaliges und leistungsfähiges modulares System entwickelt werden, das die Darstellung aller Untereinheiten in hoher Qualität und voller Funktionalität erlaubt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die schrittweise modulare Zusammensetzung von TFIIH Core ermöglicht, was es nun erlaubt den Einfluss der komplexen Wechselwirkungen innerhalb von TFIIH Core auf die enzymatischen Aktivitäten im Ganzen zu untersuchen, was bisher nicht möglich war. Mit Hilfe der Einzelproteine und dualen Komplexe wurde ein detailliertes Netzwerk aus Wechselwirkungen innerhalb TFIIH Core etabliert, welches die entscheidende Rolle der p34 Untereinheit als zentrales Gerüst für TFIIH offenbarte, da sie die Verbindung zwischen p44 und p52 herstellt. Unsere Untersuchungen deuten zudem darauf hin, dass p62 die zentrale Schnittstelle zur Umgebung von TFIIH darstellt, anstatt als Gerüst zu fungieren. Des Weiteren gelang die Assemblierung von TFIIH Core Komplexen, die mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden. Die Strukturen, die daraus hervorgingen, legen das Vorhandensein verschiedener TFIIH Konformationen nahe, welche vermutlich bei den verschiedenen Aufgaben von TFIIH in der Transkription und DNA Reparatur zum Tragen kommen. Außerdem wurde mit Hilfe eines gekürzten p62 Konstrukts eine einfach zu handhabende, kostengünstige Strategie zur Lösung des kristallografischen Phasenproblems mittels Cäsiumderivatisierung entwickelt