BROYLERDEN İZOLE EDİLEN ESCHERİCHİA COLİ’LERİN ÖNEMLİ VİRULANS GENLERİNİN VE ANTİBİYOTİK DİRENCİNİN İNCELENMESİ

BROYLERDEN İZOLE EDİLEN ESCHERİCHİA COLİ’LERİN ÖNEMLİ VİRULANS GENLERİNİN VE ANTİBİYOTİK DİRENCİNİN İNCELENMESİ İlçebaylık, A. Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Programı, Yüksek Lisans Tezi, Aydın, 2019. Kanatlı patojenik Escherichia coli (APEC)'nin neden olduğu kolibasilozis, E. coli'nin konakçıda yapışmasını ve çoğalmasını teşvik eden spesifik genler tarafından kodlanan virülens faktörleri bulunduğunda meydana gelir. Bu çalışmada, broyler iç organlarından elde edilen APEC izolatlarında sideroforları (iucD, iroN, iutA), toksinleri (astA, vatA, hlyF), adezinleri (papC, tsh), serum direncini (iss, ompT) ve kolisini (colV) kodlayan virülens gen (VG) varlığı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile ve izolatların antibiyotik dirençlerinin disk difüzyon yöntemi ile incelenmesi amaçlandı. En az beş VG taşıyan izolatlar klinik APEC (cAPEC) daha az VG taşıyanlar potansiyel APEC (pAPEC) ve en az üç veya daha fazla antimikrobiyal madde sınıfına dirençli olanlar çoklu antibiyotiğe dirençli (MDR) olarak değerlendirildi. cAPEC ve pAPEC arasındaki VG sıklığını karşılaştırmak için Ki-Kare (χ2) testi kullanıldı ve χ2 testinde P≤0.05 anlamlı olarak kabul edildi. Yüz yetmiş üç broylerden 140 (%80,1) APEC izole edildi. Çalışmanın sonunda 140 izolattan 86'sının (%61,4) cAPEC, 54'ünün (% 38,6) pAPEC olduğu ve bu izolatların 47 virülans genotipi taşıyordığı saptandı. iss (%78.6), iutA (%75.7), iroN (%68.6), hylF (%61.4), ompT (%60.0) genleri en yüksek oranda tespit edilen genlerdi. Araştırılan diğer genler ise; iucD (%40.0), tsh (%27.1), colV (%25.7), papC (%21.4), vatA (%8.6), astA (%4.3) daha düşük sıklıklarda saptandı. χ2 testi, tüm virülans genlerinin cAPEC ve pAPEC suşları arasındaki dağılımının önemli olduğunu gösterdi. Tüm izolatların, amoksisilin, trimetoprim sülfametoksazol, amoksisilin klavulanik asit ve siprofloksasine karşı yüksek düzeyde direnç gösterdiği bulundu. Birden fazla demir taşıma sistemine sahip olmanın APEC sağkalımı üzerinde önemli bir rol oynadığı, virülans genlerinin PZR yöntemiyle incelenmesinin patojenite testi yapmaktan daha pratik olduğu ve virülans genotiplerinin karakterize edildiği VG bazlı teşhis yöntemlerinin geliştirilmesinin gelecekteki aşı çalışmaları için faydalı olabileceği sonucuna varıldı.İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY SAYFASI ………………………..………………….…………... i TEŞEKKÜR …………………………………………………………….……………... ii İÇİNDEKİLER ..…………………………………………….………...………….…… iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ …..…………………….…………….…… vi ŞEKİLLER DİZİNİ ….………….…………………………...………………………… viii RESİMLER DİZİNİ ….………….…………………………...……………………….. ix TABLOLAR DİZİNİ ….………….…………………………...……………………..... x ÖZET ………………………………………………………………………………….. xi ABSTRACT …………………………………………………………………………… xii 1. GİRİŞ …………………….…………………...……………………………….…..... 1 2. GENEL BİLGİLER………………………………………………………………..... 3 2.1. İnsan Patojenik E. coli………………………….. ………………………………… 3 2.2. E. coli Patotipleri……………………………..……………………………………. 4 2.3. Kanatlı Patojenik E. coli (APEC).…………………………………………………. 5 2.4. APEC’de Enfeksiyon Modeli …………………………………………................... 8 2.5. APEC ve Gıda Güvenliği …………………………………………………………. 8 2.6. APEC’nin Yayılımı…………….. ………………………………………………… 9 2.7. APEC’nin Virülens İle İlişkili Genleri..…………………………………………… 10 2.8. Virülens ile İlişkili Genleri Belirleme Yöntemleri: Karşılaştırmalı Genom………. 17 2.9. Patojenik E. coli'nin Tanımlama Yöntemleri ……………………………………... 18 2.9.1. Konvansiyonel Yöntemler………………………………………………………. 18 2.9.2. Serotiplendirme……………………….…………………………………………. 19 2.9.3. Moleküler Tanımlama…………………………………………………………… 20 2.9.4. Diğer Faydalı Teknikler……………….………………………………………… 21 2.10. Klonal İlişki ve Patojen Klon Tespiti .……………………………..…………….. 21 2.11. Kanatlı Hayvan Endüstrisinde Kolibasilozun Etkisi. ……………………………. 22 2.12. Antibiyotikler: Ünlü Keşiflerden Uygulanan Kısıtlamalara.…………………….. 23 2.12.1. Antibiyotik Direnci: Mekanizmalar ve Kökenleri.…………………………….. 23 2.12.2. Kullanılan Antibiyotikler ve Gelişen Direnç.………………………………….. 25 3. GEREÇ VE YÖNTEM ……...……………………………………….……………... 28 iv 3.1. Gereç …………………………………………………………....…..…………...... 28 3.1.1. Cihazlar ……………………………………………………..….........………...... 28 3.1.1. İzolasyon Materyali..…………………………………………………………….. 28 3.1.2. Referans Suşlar ..……………….………………………………………………... 28 3.1.3. Besiyerleri..……………………………………………………………………… 28 3.1.3.1. MacConkey agar……………….…………. ………………………………….. 29 3.3.2. Eosine methylene blue agar…..….……………………………………………… 29 3.1.3.3. Mueller hinton agar…………. ………………………………………………... 29 3.1.3.4. Nutrient broth …………………..……………………………………………... 29 3.1.3.5. Brain hearth infusion broth……………………………………………………. 30 3.1.4. Ayıraç ve Boyalar…………………………. …………………………………… 30 3.1.4.1. Oksidaz ayıracı………………………………………………………………… 30 3.1.4.2. Gram boyama seti ………………………………….…………………………. 30 3.1.4.3. %3’lük Hidrojen Peroksit……………………………………………………… 30 3.1.5. Antibiyotik Diskleri ………………………………………….…………………. 31 3.1.6. Polimeraz Zincir Reaksiyonu………………………….……..………………….. 31 3.1.6.1. Solusyon ve boyalar…………………………………. ……………………….. 31 3.1.6.1.1. Fosfat tamponu………………………………………………………………. 31 3.1.6.1.2. Tris, borik asit, EDTA..……………………………………………………… 31 3.1.6.1.3. Yükleme tamponu…………………………………………………………… 32 3.1.6.1.5. Primerler……………………………………………………………………... 32 3.1.6.1.6. Kullanılan cihazlar…………………………………………………………... 33 3.1.6.1.7. Agaroz jel……………………………………………………………………. 34 3.1.6.1.8. Elektroforez…………………………………………………………………. 34 3.1.6.1.9. Görüntüleme………………………………………………………………… 34 3.1.6.1.10. Marker……………………………………………………………………… 34 3.2. Yöntem…………………………….……………………………….…………….... 35 3.2. 1. Bakteri İzolasyon ve İdentifikasyonu………….………………………………... 35 3.2.2. Antibiyotik Duyarlılık Testi………………….….………………………………. 35 3.2.3. DNA İzolasyonu, Saflık Kontrolleri ve Miktar Tayinleri ..……………………... 36 3.2.4. PZR……….………………………….………………………………………….. 37 3.2.5. APEC Değerlendirme Kriterleri…………………………………………………. 38 3.2.6. İstatistiksel Analiz………………….…………….…………………….………... 38 v 4. BULGULAR ……………………………………………………………………....... 39 4.1. İzolasyon ve İdentifikasyon…………………..……………………..…………….. 39 4.1.1. Fenotipik………………………..……………………..………………………… 39 4.1.2. Genotipik.……………………..……………………..…………………………... 39 4.2. Virülens Genotiplendirme…………….……………..……………………………. 40 4.3. İstatistiksel Analiz…………………..…..……………………..…………………... 43 4.4. Antibiyotik Dirençlilik………………………………………… …………………. 45 4.1. APEC, cAPEC ve pAPEC İzolatlarında Çoklu Antibiyotik Dirençlilik Durumularının Karşılaştırılması……………………………………………………….. 46 5. TARTIŞMA …………...……….…………………...……...….……………...…...... 48 6. SONUÇ VE ÖNERİLER ……………………………..…………..……….………... 53 KAYNAKLAR ..………………………………...……...……………………………... 55 ÖZGEÇMİŞ …………………………………………...………………………………. 6