Immuno Magnetic Thermosensitive Liposomes For Cancer Therapy

The present work describes the encapsulation of the drug doxorubicin (DOX) in immuno paramagnetic thermosensitive liposomes. DOX is the most common chemotherapeutic agent for the treatment of a variety of carcinomas. However, the pure drug has high cytotoxicity and therefore requires a targeted and biocompatible delivery system. The introduction includes concepts, modalities, and functionalities of the project. First, a detailed description of the cell type (triple-negative breast cancer) is given. Furthermore, the importance of liposomal doxorubicin is explained and the current state of research is shown. The importance of modification to achieve thermosensitive properties and the procedure for co-encapsulation with Gd chelate to achieve paramagnetic properties is also discussed. In addition, the first part describes the surface modification with ADAM8 antibodies, which leads to improved targeting. The second part of the thesis covers the different materials and methods used in this paper. The production of the liposomes LipTS, LipTS-GD, LipTS-GD-CY, LipTS-GD-CY-MAB and the loading of DOX using an ammonium sulfate gradient method were described in detail. The results part deals with the physicochemical characterization using dynamic light scattering and laser Doppler velocimetry, which confirmed a uniform monodisperse distribution of the liposomes. These properties facilitate the approach of liposomes to target cancer cells. The influence of lipid composition of liposomes, co-encapsulation with Gd chelate and surface modification of liposomes was evaluated and described accordingly. The size and structure of the individual liposomal formulations were determined by atomic force microscopy and transmission electron microscopy. Morphological examination of the liposomes confirmed agreement with the sizes obtained by dynamic light scattering. Temperature-dependent AFM images showed an intact liposome structure at 37 °C, whereas heating by UHF-MRI led to a lipid film indicating the destruction of the lipid bilayer. Furthermore, TEM images showed the morphological properties of the liposomes and gave a more precise indication of how Gd-chelate accumulates within the liposomes. Liposomes with Gd-chelate showed well-separated vesicles, suggesting that Gd- chelate is deposited in the lipid bilayer of the liposomes. Gd was encapsulated in the hydrophilic core whereas chelate was extended into the lipid bilayer. By differential scanning calorimetry and drug release, the heat-sensitive functionality of the liposomes could be determined. Liposomes showed a beginning of phase transition temperature at about 38 °C, which can be achieved by UHF-MRI exposure. The maximum phase transition temperature in the case of LipTS-GD and LipTS-GD-CY-MAB was 42 °C and 40 °C, respectively. A proof of concept study for the thermosensitive properties of liposomes and a time-dependent DOX release profile in hyperthermia was performed. Gd-chelate is encapsulated in both LipTS-GD and LipTS-GD-CY-MAB and led to paramagnetic properties of the liposomes. This facilitates imaging mediated DOX delivery and diagnosis of the solid tumor and metastatic cells. The change in relaxation rate R1 of liposomes was quantified before and after heating above Tm (T> Tm). The relaxivity of the liposomes was obtained from the adapted slope of the relaxation rate against the Gd concentration. Remarkably, the relaxation rate and relaxivity increased after heating the liposomes above Tm (T> Tm), suggesting that the liposomes opened, released Gd chelate, and the exchange of water molecules became faster and more practicable. Toxicity studies describe the different mechanisms for induced DOX toxicity. The increased cytotoxic effect at elevated temperatures showed that the induced toxicity is thermally dependent, i.e. DOX was released from the liposomes. The high viability of the cells at 37 °C indicates that the liposomes were intact at normal physiological temperatures. Under UHF-MRI treatment, cell toxicity due to elevated temperature was observed. The cellular uptake of liposomes under UHF-MRI was followed by a confocal laser scanning microscope. An increase in fluorescence intensity was observed after UHF-MRI exposure. The study of the uptake pathway showed that the majority of liposomes were mainly uptake by clathrin-mediated endocytosis. In addition, the liposomes were modified with anti-ADAM8 antibodies (MAB 1031) to allow targeted delivery. The cellular binding capabilities of surface-modified and non-modified liposomes were tested on cells that had ADAM8 overexpression and on ADAM8 knockdown cells. Surface-modified liposomes showed a significant increase in binding ability, indicating significant targeting against cells that overexpress ADAM8 on their surface. In addition, cells with knockdown ADAM8 could not bind a significant amount of modified liposomes. The biocompatibility of liposomes was assessed using a hemolysis test, which showed neglected hemolytic potential and an activated thromboplastin time (aPTT), where liposomes showed minimal interference with blood clotting. Hemocompatibility studies may help to understand the correlation between in vitro and in vivo. The chorioallantois model was used in ovo to evaluate systematic biocompatibility in an alternative animal model. In the toxicity test, liposomes were injected intravenously into the chicken embryo. The liposomes showed a neglectable harmful effect on embryo survival. While free DOX has a detrimental effect on the survival of chicken embryos, this confirms the safety profile of liposomes compared to free DOX. LipTS-GD-CY-MAB were injected into the vascular system of the chicken embryo on egg development day 11 and scanned under UHF-MRI to evaluate the magnetic properties of the liposomes in a biological system with T2-weighted images (3D). The liposomal formulation had distinct magnetic properties under UHF MRI and the chick survived the scan. In summary, immunomagnetic heat-sensitive liposomes are a novel drug for the treatment of TNBC. It is used both for the diagnosis and therapy of solid and metastasizing tumors without side effects on the neighboring tissue. Furthermore, a tumor in the CAM model will be established. Thereafter, the selective targeting of the liposomes will be visualized and quantitated using fluorescence and UHF-MRI. Liposomes are yet to be tested on mice as a xenograft triple-negative breast cancer model, in which further investigation on the effect of DOX-LipTS-GD-CY-MAB is evaluated. On one hand, the liposomes will be evaluated regarding their targetability and their selective binding. On the other hand, the triggered release of DOX from the liposomes after UHF-MRI exposure will be quantitated, as well as evaluate the DOX-Liposomes therapeutic effect on the tumor.Die vorliegende Arbeit beschreibt die Verkapselung des Arzneistoffs Doxorubicin (DOX) in immunparamagnetische thermosensitive Liposomen. DOX ist das häufigste Chemotherapeutikum zur Behandlung einer Vielzahl von Karzinomen. Jedoch besitzt der reine Arzneistoff eine hohe Zytotoxizität und erfordert somit ein gezieltes und biokompatibles Trägersystem. Das einleitende Kapitel dieser Arbeit umfasst Konzepte, Modalitäten und Funktionalitäten des Projektes. Es findet zunächst eine detaillierte Beschreibung des Zelltyps (dreifach-negativer Brustkrebs) statt. Des Weiteren wird die Bedeutung von liposomalem DOX erklärt und der aktuelle Forschungsstand aufgezeigt. Die Bedeutung der Modifikation zur Erzielung der thermosensitiven Eigenschaften und die Vorgehensweise zur Co-Verkapselung mit Gd-Chelat um paramagnetische Eigenschaften zu erreichen wird ebenfalls behandelt. Zudem wird im ersten Teil die Oberflächenmodifikation mit ADAM8-Antikörper beschrieben, was zu einem verbesserten Targeting führt. Der zweite Teil der Arbeit umfasst die verschiedenen Materialien und Methoden, die in der vorliegende Arbeit zum Einsatz kamen. Die Herstellung der Liposomen LipTS, LipTS-GD, LipTS-GD-CY, LipTS-GD-CY-MAB und die Beladung von DOX unter Verwendung eines Ammoniumsulfatgradienten wurden detailliert beschrieben. Das erste Kapitel des Ergebnisteils behandelt die physikalisch-chemische Charakterisierung mittels dynamischer Lichtstreuung und Laser-Doppler-Velocimetrie, welche eine gleichmäßige monodisperse Verteilung der Liposomen bestätigte. Diese Eigenschaften erleichtern die Annäherung der Liposomen an die Zielkrebszellen. Der Einfluss der Lipidzusammensetzung der Liposomen, der Co-Verkapselung von Gd-Chelat und der Oberflächenmodifikation der Liposomen wurde entsprechend bewertet und beschrieben. Größe und Struktur der einzelnen liposomalen Formulierungen wurden mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie und Transmission-selektronenmikroskopie bestimmt. Die morphologische Untersuchung der Liposomen bestätigte eine Übereinstimmung mit den Größen, die durch dynamische Lichtstreuung erhalten wurden. Temperaturabhängige AFM-Bilder zeigten eine intakte Liposomenstruktur bei 37 °C, wohingegen eine Erhitzung durch UHF-MRI, zu einem Lipidfilm führte, der auf die Zerstörung der Lipiddoppelschicht hinwies. Des Weiteren zeigten TEM-Bilder die morphologischen Eigenschaften der Liposomen und gaben einen genaueren Hinweis wie sich Gd-Chelat innerhalb der Liposomen anlagert. Liposomen mit Gd-Chelat zeigten gut getrennte Vesikel, was darauf hindeutete, dass sich Gd-Chelat in der Lipiddoppelschicht der Liposomen einlagert. Gd wurde in den hydrophilen Kern der Liposomen vereingekapselt, wohingegen das Gd-chelat in die Lipidmembran ragt. Durch dynamische Differenzkalorimetrie und temperaturabhängige Arzneimittelfreisetzung konnte die Wärmeempfindlichkeit der Liposomen bestimmt werden. Liposomen zeigten einen Beginn der Phasenübergangstemperatur bei etwa 38 °C, was ebenfalls unter UHF-MRT-Exposition erreicht werden kann. Das Maximum dieser Temperatur lag im Fall von LipTS-GD und LipTS-GD-CY-MAB bei 42 und 40 °C. Eine „Proof-of-Concept-Studie“ für die thermosensitiven Eigenschaften der Liposomen sowie ein zeitabhängiges DOX-Freisetzungsprofil bei Hyperthermie wurde erstellt. Gd-Chelat ist sowohl in LipTS-GD als auch in LipTS-GD-CY-MAB enthalten und führte daher zu paramagnetischen Eigenschaften dieser Liposomen. Dies ermöglichte die UHF-MRT-vermittelte DOX-Freisetzung sowie die Diagnostik solider Tumore und metastasierender Zellen. Die Änderung der Relaxationsrate R1 der Liposomen wurde vor und nach dem Erhitzen über Tm (T> Tm) quantifiziert. Die Relaxivität der Liposomen wurde aus der berechneten Steigung der Relaxationsrate gegen die Gd-Konzentration erhalten. Bemerkenswerterweise erhöhten sich die Relaxationsrate und die Relaxivität nach dem Erhitzen der Liposomen über Tm (T> Tm), was darauf hinweist, dass sich die Liposomen öffneten, Gd-Chelat freisetzten und der Austausch von Wassermolekülen schneller und praktikabler wurde. Toxizitätsstudien beschreiben die verschiedenen Mechanismen für die induzierte DOX-Toxizität. Die stärkere zytotoxische Wirkung bei erhöhten Temperaturen zeigt eine thermisch induzierte Toxizität, d.h. es kam zu einer Freisetzung von DOX aus den Liposomen bei erhöhter Temperatur. Die Überlebensrate der Zellen bei 37 °C deutet darauf hin, dass die Liposomen bei normalen physiologischen Temperaturen intakt waren. Unter UHF-MRT-Behandlung wurde eine Zelltoxizität aufgrund einer erhöhten Temperatur erreicht. Die Verfolgung der zellulären Aufnahme der Liposomen unter UHF-MRT fand mit Hilfe der konfokaler Lasermikroskopie statt. Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität wurde nach UHF-MRT-Exposition beobachtet. Die Untersuchung des Aufnahmewegs zeigte, dass die Mehrzahl der Liposomen hauptsächlich durch Clathrin-vermittelte Endozytose aufgenommen wurden. Darüber hinaus wurden die Liposomen mit Anti-ADAM8-Antikörper (MAB 1031) modifiziert um ein gezieltes Targeting zu ermöglichen. Die zellulären Bindungsfähigkeiten der oberflächenmodifizierten und nicht-modifizierten Liposomen wurden auf Zellen getestet, die eine ADAM8-Überexpression hatten, sowie auf ADAM8-Knockdown-Zellen. Oberflächenmodifizierte Liposomen zeigten einen signifikanten Anstieg der Bindungsfähigkeiten, was auf ein signifikantes Targeting gegen Zellen hinweist, die ADAM8 auf ihrer Oberfläche überexprimieren. Zusätzlich konnten Zellen mit Knockdown-ADAM8 keine signifikante Menge an modifizierten Liposomen binden. Die Bewertung der Biokompatibilität der Liposomen wurde unter Verwendung eines Hämolysetests und einer aktivierten Thromboplastinzeit (aPTT) bestimmt. Liposomen zeigten ein vernachlässigbares hämolytisches Potential. Ebenso zeigen aPTT-Studien, dass Liposomen die Blutgerinnung nicht stören. Hämokompatibilitätsstudien können helfen, die Korrelation zwischen in vitro und in vivo zu verstehen. Zur bewertung der systemischen Biokompatibilität wurde das in ovo Chorioallantoismembranmodell verwendet, das einen alternativen Tierversuch darstellt. Im Toxizitätstest wurden Liposomen intravenös in die Hühnerembryonen injiziert. Die Liposomen zeigten eine vernachlässigbar schädliche Wirkung auf die Entwicklung des Embryos. Während freies DOX einen schädlichen Effekt auf das Überleben der Hühnerembryonen hatte, dies bestätigt das verbesserte Sicherheitsprofil der Liposomen im Vergleich zu freiem DOX. LipTS-GD-CY-MAB wurden am Eierentwicklungstag 11 in das Gefäßsystem des Hühnerembryos injiziert und unter UHF-MRT gescannt, um die magnetischen Eigenschaften der Liposomen in einem biologischen System mit T2-gewichteten Bildern (3D) zu bewerten. Die liposomale Formulierung hatte erkennbare magnetische Eigenschaften unter UHF-MRT und das Küken überlebte den Scan. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass immunomagnetische wärmeempfindliche Liposomen eine neuartige Arzneiform zur TNBC-Behandlung darstellen könnte. Sie dient sowohl zur Diagnose als auch zur Therapie von soliden und metastasierenden Tumore ohne Nebenwirkungen auf das Nachbargewebe zu haben. Das weitere Vorgehen besteht darin einen Tumor im CAM-Modell zu etablieren, das selektive Targeting der Liposomen zu visualisieren und mittels Fluoreszenz sowie UHF-MRT zu quantifizieren. Ebenso müssen die Liposomen an Mäusen als dreifach-negatives Brustkrebsmodell im Xenograft-Verfahren getestet werden, um weitere Wirkungen von DOX-LipTS-GD-CY-MAB zu untersuchen. Zum einen sollen die Liposomen hinsichtlich ihrer Zielbarkeit und ihrer selektiven Bindung bewertet werden. Andererseits wird die ausgelöste Freisetzung von DOX aus den Liposomen nach UHF-MRT-Exposition und die therapeutische Wirkung von DOX-Liposomen auf den Tumor bewertet