Caracterização funcional das delta-amastinas de Trypanosoma cruzi

Orientador: Dr. Wanderson Duarte Da RochaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 29/02/2012Inclui referências: p. 90-94Resumo: A doença de Chagas tem como agente etiológico o Trypanosoma cruzi. O estudo da composição proteica da superfície do parasito é de extrema importância, visto que nela se encontra a primeira linha de contato com a célula hospedeira. A forma replicativa no hospedeiro vertebrado (amastigota) possui a sua composição proteica da superfície ainda pouco descrita, mas sabe-se que algumas das proteínas já identificadas são de grande relevância para a resposta imune e persistência da infecção no decorrer da doença. Dentre as proteínas identificadas para esta forma destacam-se as amastinas, que são 50 vezes mais expressas em amastigota em comparação com as demais formas e possuem expressão diferenciada em linhagens de T. cruzi. Elas são codificadas por famílias multigênicas é composta por 174 aminoácidos com 4 regiões transmembranas (sendo que no N-terminal existe um provável peptídeo sinal) e 3 hidrofílicas. Nessas proteínas é possível identificar vários sítios potenciais de O-glicosilação. No genoma de T. cruzi, cepa CL Brener, é possível encontrar 3 tipos de amastinas as ?-amastinas, p?-amastina e ?-amastinas. A fim de elucidar a função das amastinas, investigamos as alterações fenotípicas causadas pela superexpressão de ?-amastinas mutadas fusionadas com GFP em epimastigotas de cepa G T. cruzi (cepa que não expressa amastina). Nós optamos pelas mutações, porque estudos de função gênica das amastinas em T. cruzi são limitados, devido a sua estrutura multigênica e a ausência da maquinaria iRNA neste tripanossomatídeo. Neste trabalho substituimos em ?- amastina (TcA21) fusionada com GFP, resíduos de aminoácidos conservados de treonina nas posições 37, 40, 44, 55 e 60 (5TM), possíveis pontos de Oglicosilação, e cisteína na posição 42 (1CM), que pode formar pontes dissulfeto, por alanina. Também fizemos outra construção contendo a região do provável peptídeo sinal fusionado com GFP (SP). Os clones dos parasitos transfectados superexpressando as amastinas selvagens em fusão com GFP (AF) e 1CM, apresentaram as proteínas em fusão com GFP localizadas na membrana citoplasmática, já o para o transfectado 5TM foi possível notar que além da localização de membrana citoplasmática o parasito apresenta uma localização dispersa no citoplasma. A localização do SP é evidenciada principalmente no envoltório perinuclear, mas também apresenta uma localização dispersa no citoplasma. As análises dos Western blots do extrato protéico total confirmaram a expressão das proteínas com os tamanhos esperados de 44,16 kDa para AF, 5TM e 1CM e 33,31 kDa para o SP. Os Western blots das frações enriquecidas solúveis citoplasmáticas e organelares e fração enriquecida de membrana, confirmaram a localização das construções AF, 5TM, 1CM e SP nas frações enriquecidas de membrana. As análises dos Western blots em diferentes condições de desnaturação sugerem que a amastina não seja glicosilada e que a banda de alto peso molecular encontrada seja um artefato, devido a agregação protéica gerada pela alta temperatura e a concentração de ?-mercaptoetanol. As culturas dos transfectados não apresentam diferenças na taxa de crescimento, mas apresentam uma alteração no número de tripomastigota em cultura envelhecida. O transfectado AF apresenta uma taxa de diferenciação significativamente superior a dos demais. Já os mutantes 5TM e 1CM se comportam como o selvagem. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, amastigota, amastina.Abstract: Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. The study of protein composition of the surface of the parasite is extremely important, since it is the first line of contact with the host cell. The replicative form in the vertebrate host (amastigotes) has its protein composition of the surface still poorly described, but it is known that some of the proteins already identified are of great relevance for the immune response and persistence of infection during the disease. Among the proteins identified for this form amastins stand out, which is 50 times as expressed in amastigotes in comparison with other forms and has differential expression in strains of T. cruzi. They are encoded by multigene families are composed of 174 amino acids with four transmembrane regions (where the Nterminus has a potential signal peptide) and third hydrophilic proteins can be identified that several potential sites for O-glycosylation. T. cruzi CL is possible to find three types of the amastin, the ?-amastins, p?-amastin and ?-amastins. In order to elucidate the function of amastins, we investigated the phenotypic changes caused by over expression of ?-amastinas mutated fused with GFP in epimastigotes of strain G T. cruzi (strain that does not express amastin). We opted for change because studies of gene function in T. amastins cruzi infection are limited due to its structure and the absence of multigene machinery IRNA this trypanosomatid. In this work we replace in ?-amastin (TcA21) fused to GFP, the amino acid residues conserved threonine at positions 37, 40, 44, 55 and 60 (5TM), possible points of O-glycosylation, and cysteine at position 42 (1cm) , which may form disulfide bonds, by alanine. We also made another construct containing the region of probable signal peptide fused to GFP (SP). Clones of transfected parasites over expressing the wild amastins fused with GFP (AF) and 1CM were located in the cytoplasmic membrane, as for the transfected 5TM was possible to note that beyond the cytoplasmic membrane localization of the parasite is located in a dispersed in the cytoplasm and nuclear envelope, the same marking on the nuclear envelope and cytoplasmic was observed in transfected SP (which has no marking on the cytoplasmic membrane). Analyses of Western blots of total protein extracts confirmed the expression of proteins with the expected sizes of 44.16 kDa for AF and 5TM and 1CM and 33.31 kDa for the SP. The Western blots of fractions enriched organelares soluble cytoplasmic and membrane-enriched fraction and confirmed the location of buildings AF, 5TM, 1CM and SP fractions enriched in the membrane. The analysis of Western blots in different denaturing conditions suggests that amastina not glycosylated and that the band of high molecular weight found to be an artifact due to protein aggregation generated by the high temperature and concentration of ?- mercaptoethanol. The transfected cultures do not exhibit the differentiation in growth rate, but have a change in the number of aged trypomastigote in culture. The transfected AF has a significantly higher rate of differentiation of the other. Since the mutants 5TM 1CM and behave like the wild. Keywords: Trypanosoma cruzi, amastigote, amastin