THE ROLE OF ECHINOCHROME A (ECHA), DERIVED FROM SEA URCHIN L. VARIEGATUS, ON BREAST CANCER TUMOR CELLS.

O câncer de mama, em mulheres, é o tipo tumoral mais frequente, e a primeira causa de morte associada ao câncer. As decisões de tratamento baseiam-se na classificação clínica do subtipo tumoral e envolvem hormônio/imunoterapia, radio/quimioterapia e mastectomia. No entanto, as taxas de recorrência do tumor são altas reforçando a importância de estudos visando novas abordagens terapêuticas. Entre essas abordagens, destaca-se a busca de novos fármacos anti-neoplásicos de origem natural, especialmente derivados de organismos marinhos, como os equinodermos que representaram, em 2016, 42% de todas as novas moléculas de origem marinha. Entre essas moléculas está o Equinocromo A (EchA) que foi identificado como um potente antiviral, antibacteriano, antioxidante e cardioprotetor. Estruturalmente, EchA é classificado como naftoquinona, e essa classe de moléculas é conhecida por exercer atividade antitumoral. Desta forma, objetivou-se avaliar a ação antitumoral do EchA, derivado de ouriço-do-mar L. variegatus, em linhagens humanas derivadas de carcinoma mamário. Para tanto, o EchA foi purificado através de RP-HPLC, seguido por LC-MS e diluído em etanol na concentração estoque de 10mM para o tratamento celular. A primeira etapa do trabalho envolveu a determinação do IC50 do EchA em linhagens celulares normais (fibroblastos e MCF10A) e tumorais (MDA-MB-231 e MCF7). Posteriormente, as células tumorais foram submetidas a ensaios in vitro com diferentes concentrações de EchA para determinar o efeito do composto na morfologia celular, viabilidade, migração e adesão. O potencial migratório e invasivo das células MDA-MB-231 tratadas com EchA foi avaliado por meio de ensaio de feridas, transwell, quantificação da ativação de RhoGTPase e concentração de citocinas IL-6, IL-8 e IL-1&#223. Observando alterações na secreção dessas citocinas, optou-se por analisar o efeito antiangiogênico do EchA nas células HUVEC. Adicionalmente, o efeito coadjuvante de EchA foi avaliado durante o tratamento de MDA-MB-231 com tamoxifeno, de modo a testar se EchA aumentaria os efeitos citotóxicos deste quimioterápico. Os resultados demonstram que altas concentrações de EchA são citotóxicas para todas as linhagens celulares estudadas, sendo mais pronunciadas em células MCF10A normais e menos pronunciadas em fibroblastos. Entre as linhagens tumorais, a MDA-MB-231 apresentou maior resistência em relação a MCF7. Adicionalmente, o EchA afeta a distribuição de F-actina de maneira dose-dependente em ambas as linhagens tumorais, sendo mais pronunciada nas células MDA-MB-231, que apresentaram uma diminuição no potencial de formação de colônias. Além disso, baixas concentrações de EchA alteram a distribuição de F-actina, &#945-tubulina e fosfo-FAK, além de diminuir a ativação de Cdc42 nessas células agressivas, diminuindo o potencial migratório, invasivo e de adesão, sem afetar a viabilidade. Por outro lado, quando associado ao tratamento com tamoxifeno, o EchA não se mostrou capaz de potencializar de forma expressiva os seus efeitos citotóxicos. Após a análise das citocinas, constatou-se que o EchA foi capaz de diminuir a secreção de IL-6, IL-8 e IL-1&#223 pelas células MDA-MB-231 em aproximadamente 40, 25 e 50%, respectivamente, indicando que o composto possa ter atividade antiangiogênica. O ensaio de angiogênese foi realizado com células endoteliais em co-cultura com fibroblastos em ambiente tridimensional de gel de fibrina. Células HUVECs tratadas com meio condicionado de MDA-MB-231 expostas ao EchA apresentaram diminuição no brotamento vascular, indicando diminuição na angiogênese. Em conjunto, nossos dados demonstram que o EchA inibe o potencial de células MDA-MB-231 em induzir angiogênese nas células HUVECs, sugerindo que o EchA possa ser uma terapia adjuvante promissora para o câncer de mama, possivelmente atuando de forma indireta no desenvolvimento tumoral, inibindo a progressão por meio da diminuição da angiogênese.Breast cancer is the most frequent tumor type in women, being the leading cause of cancer-related death in females. Treatment decisions are based on the clinical classification of the tumor subtype and involve hormone and immunotherapy, radio/chemotherapy, and mastectomy. However, tumor recurrence rates are high, especially in patients with triple-negative breast cancer, leading many studies to look for new therapeutic approaches. Thus, considerable efforts have been made in the search for new anti-neoplastic drugs of natural origin, mainly derived from marine organisms, since this habitat is a rich source of bioactive secondary metabolites, which have chemical structural diversity. In 2016, the echinoderms stood out as a source for the discovery of 42% of all new molecules of marine origin. Among them, Echinochrome A (EchA) has been identified as potent antiviral, antibacterial, antioxidant, and cardio protective. Structurally, EchA is classified as naphthoquinone, and this class of molecules is known to exert antitumor activity. Based on this, we decided to analyze the antitumor properties of this compound in the treatment of mammary tumor cells. For this, EchA was purified by RP-HPLC, followed by LC-MS, and diluted in ethanol to a stock concentration of 10mM for cell treatment. The first step of the work involved the determination of the EchA IC50 in normal-like cell lines (fibroblasts and MCF10A cells), and tumor cells (MDA-MB-231 and MCF7), which were subjected to in vitro assays with different concentrations of EchA to determine the effect of the compound on cell morphology, viability, migration, and adhesion. MDA-MB-231 cells were chosen to have their migratory potential evaluated by wound testing, transwell, and quantification of Rho GTPase activation. The concentration of cytokines IL-6, IL-8 and IL-1&#223 were analyzed in the conditioned medium of those cells, exposed or not to EchA. And changes in the secretion of these cytokines lead us to analyze the antiangiogenic effect of EchA on HUVEC cells. In addition, the adjuvant effect of EchA was also evaluated during tamoxifen treatment of MDA-MB-231 in order to test if EchA could increase the cytotoxic effects of this chemotherapy. Our data show that high concentrations of EchA are cytotoxic to all studied cell lines, being more pronounced in normal MCF10A cells and less pronounced in fibroblasts. Among the tumor lines, MDA-MB-231 presented higher resistance compared to MCF7. Additionally, EchA affects the distribution of F-actin in both tumor strains; this change is more pronounced in MDA-MB-231 cells, which showed a decreased colony formation potential. In addition, low concentrations of EchA alter the distribution of F-actin, &#945-tubulin, and pFAK, and also decrease Cdc42 activation in MDA-MB-231 cells, decreasing their migration, invasion and adhesion potential without affecting viability. On the other hand, when associated with tamoxifen treatment, EchA did not potentiate its cytotoxic effects. After cytokine analysis, we found that EchA was able to decrease the secretion of IL-6, IL-8 and IL-1&#223 by MDA-MB-231 cells by 40, 25 and 50%, respectively, indicating that the compound may have antiangiogenic activity. Thus, angiogenesis assay was performed with endothelial cells in co-culture with fibroblasts in a three-dimensional fibrin gel environment. The sprouting of HUVECs cells treated with MDA-MB-231 conditioned medium exposed to EchA was decreased, indicating reduced angiogenesis. Taken together, our data demonstrate that EchA inhibits the potential of MDA-MB-231 cells to induce angiogenesis in HUVECs cells, suggesting that EchA may be a promising adjunctive therapy for breast cancer, possibly acting indirectly on tumor development, through inhibition of tumor progression by decreasing angiogenesis