Next generation sequencing and its application on the genetic study of Waardenburg syndrome

A síndrome de Waardenburg (SW) é caracterizada por perda auditiva ou surdez e alterações pigmentares dos olhos, cabelo e pele. A incidência de todas as formas da SW é estimada em 1/42,000. Clinicamente foi classificada em quatro tipos. A SW tipo 1 (SW1, OMIM #193500) e a SW tipo 2 (SW2, OMIM #193510) compartilham muitas características em comum e são diferenciadas pela ocorrência de telecanto na SW1. A SW tipo 3 (SW3, OMIM #148820) é semelhante à SW1 com adição de anormalidades dos membros superiores. Na SW tipo 4 (SW4, OMIM #277580), além dos distúrbios auditivos e pigmentares, ocorre a doença de Hirschsprung (DH). A maioria dos casos de SW1 e SW3 são causados por mutações no gene PAX3; os casos de SW2 são causados por mutações nos genes MITF, SOX10, EDNRB, EDN3, KITLG e SNAI2. Mutações dos genes SOX10, EDNRB e EDN3 também estão relacionadas à SW4. Apesar dos esforços na caracterização genético-molecular da SW, em todos os tipos há casos sem alteração molecular detectada. No Laboratório de Genética IB-USP há uma vasta casuística de pacientes com SW cujo material genético foi analisado por sequenciamento pelo método de Sanger dos principais genes associados à síndrome. Em alguns deles, foi realizada também a técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) para excluir alterações no número de cópias nos genes já conhecidos. Essas estratégias permitiram a identificação da causa da doença em parte dos casos, restando casos sem caracterização molecular conclusiva. O objetivo desse estudo é, por meio do sequenciamento massivo paralelo do exoma, detectar alterações genéticas não detectadas pelas técnicas anteriores em genes já conhecidos ou então encontrar novos genes alterados relacionados à SW. Assim, tivemos como meta contribuir com a caracterização de novos genes ou de novos mecanismos mutacionais que expliquem a SW. Os probandos de 25 famílias brasileiras com diagnóstico clínico de SW1 (8) ou SW2 (17) tiveram seu material genético analisado por meio do sequenciamento massivo paralelo do exoma. Variantes causativas da SW foram detectadas em 10 dos 25 probandos analisados, sendo quatro no gene PAX3, quatro no gene MITF e duas no gene SOX10. Em seis dessas famílias submetidas à análise de trio (comparação dos exomas de probando-pai-mãe), uma probanda teve a variante causativa detectada no gene ACTG1, o que levou à conclusão que se tratava de síndrome de Baraitser-Winter tipo 2 (OMIM #614583). Um segundo trio analisado permitiu sugerir o gene PRAG1 como candidato a explicar a ocorrência de canície. Nos 14 casos sem variante causativa detectada, uma análise comparativa de genes em comum contendo variantes, indicou os genes candidatos ARHGAP23, ERBB3, P4HA3, FOXM1, GGT1 e PRTG, cada um alterado em três pacientes ou mais. Os genes com maior potencial de estarem associados aos fenótipos de SW, após a revisão da literatura, são FOXM1 e PRTG. Os genes contendo variantes filtradas nos 14 pacientes também foram comparados a duas listas de genes por nós construídas. A primeira lista consiste de genes obtidos a partir da construção de uma rede de proteínas relacionadas às proteínas conhecidas da SW. Essa análise comparativa evidenciou variantes nos genes MAP3K5, EP300 e MDM4 como candidatas. A comparação da lista de variantes dos 14 pacientes com a segunda lista, composta por todos os genes já associados ao fenótipo de surdez sindrômica e não sindrômica, evidenciou variantes nos genes EYA1, CHD7, MYO7A, TBC1D24, COL4A5, TECTA, TNC, MYH9, COL11A2 e >DIAPH3. Destes, os mais potencialmente relacionados aos fenótipos de SW seriam EYA1 e CHD7. Estudos de segregação nas famílias são necessários para elucidar o papel desses genes como candidatos a explicar o fenótipo de SW, isoladamente ou em combinaçãoWaardenburg syndrome (WS) is characterized by hearing loss or deafness and pigmentary abnormalities of eyes, hair and skin. The incidence of all types of WS is estimated at 1/42,000. It has been clinically classified in four types. WS type 1 (WS1, OMIM #193500) and WS type 2 (WS2, OMIM #193510) share many characteristics and are differentiated by the occurrence of telecanthus only in WS1. WS type 3 (WS3, OMIM #148820) is similar to WS1, with the addition of upper limb anomalies. In WS type 4 (WS4, OMIM #277580), besides hearing and pigmentary disturbances, Hirschsprung disease also occurs. Most cases of WS1 and WS3 are caused by mutations in the PAX3; WS2 cases are caused by mutations in MITF, SOX10, EDNRB, EDN3, KITLG e SNAI2. Mutations in the SOX10, EDNRB and EDN3 genes are also a cause for WS4. Despite the efforts in the genetic-molecular characterization of WS, in all types there are cases with no molecular change detected. At the Laboratório de Genética IB-USP there is a large sample of patients with WS whose genetic material was previously sequenced by the Sanger method, in the main genes associated with the syndrome. In some, the MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) technique was performed to exclude copy number alterations in the known genes. These strategies allowed the identification of the cause of the disease in part of the cases, leaving some without conclusive molecular characterization. The aim of this study is, by using exome sequencing, to detect genetic changes not detected by prior techniques in order to find new altered genes related to WS. Our goal was to contribute to the characterization of new genes or new mutational mechanisms that explain WS. The probands of 25 Brazilian families with clinical diagnosis of WS1 (8) or WS2 (17) had their genetic material analyzed by exome sequencing. Causative variants of WS were detected in 10 of the 25 probands analyzed, being four in PAX3, four in MITF and two in SOX10. In six of these families submitted to trio analysis (comparison of proband-father-mother exomes), one proband had the causative variant detected in the ACTG1 gene, which led to the conclusion that it was type 2 Baraitser-Winter syndrome (OMIM #614583). A second analysed trio showed the PRAG1 gene as a candidate to explain the occurrence of canities. Among the 14 cases with no causative variant detected, a comparative analysis of genes containing variants revealed the genes ARHGAP23, ERBB3, P4HA3, FOXM1, GGT1 and PRTG, each one altered in three patients or more. After literature review, those with the highest potential to be associated with WS phenotypes are FOXM1 e PRTG. The genes containing filtered variants in the 14 patients were also compared to two lists of genes constructed by us. The first list consists of genes obtained from the construction of a protein network related to known WS proteins. This comparative analysis showed candidate variants in the MAP3K5, EP300 and MDM4 genes. Comparison of the variant lists of the 14 patients with a second list, composed by all genes already associated with syndromic and non-syndromic hearing loss phenotype, showed variants in the EYA1, CHD7, MYO7A, TBC1D24, COL4A5, TECTA, TNC, MYH9, COL11A2 and DIAPH3 genes. Of these, the most potentially related to WS phenotypes would be EYA1 and CHD7. Family segregation studies are needed to elucidate the role of these genes as candidates to explain the WS phenotype, either isolated or in combination