Análisis morfocinético utilizando un sistema de time-lapse automatizado

INTRODUCCIÓN: La necesidad de mejorar la tasa de gestación en los tratamientos de fecundación in vitro ha promovido que se trabaje e investigue más exhaustivamente tanto a nivel médico como tecnológico para ser capaces de distinguir, con la mayor precisión posible, embriones que van a tener éxito de los que no. Por ello, el compromiso de mejorar la tasa de embarazo a través de técnicas de fecundación in vitro debería encaminarse a la búsqueda de nuevos marcadores de calidad embrionaria para la identificación de mejores embriones que den lugar a descendencia sana. Es importante destacar que conseguir un embarazo a término es nuestro objetivo principal como profesionales en el campo de la reproducción asistida. En la mayoría de los casos, los pacientes no son conscientes del riesgo que conlleva una gestación múltiple y por ello se muestran reacios a aceptar una transferencia única. Por ello, actualmente existen muchos grupos de investigación buscando marcadores de viabilidad embrionaria capaces de suplementar los criterios de selección embrionaria actuales con el fin de aumentar, o al menos mantener la tasa de gestación con transferencias embrionarias electivas y únicas, minimizando los embarazos múltiples. La tecnología time-lapse consiste en incorporar al incubador un sistema de captura de imágenes con el objetivo de poder estudiar los tiempos exactos en los que se producen los diferentes eventos del desarrollo embrionario. De este modo, la combinación de parámetros morfocinéticos utilizando la tecnología de time-lapse, y los parámetros morfológicos utilizados convencionalmente, podría ser considerada como un nuevo marcador de viabilidad embrionaria, siendo de gran utilidad en la mejora de la selección embrionaria desde un punto de vista dinámico. La base de esta nueva tecnología está basada en los tiempos exactos de las divisiones celulares y duración de los ciclos celulares. Actualmente, la selección embrionaria de manera rutinaria se basa en criterios morfológicos subjetivos obtenidos a partir de la evaluación de los mismos mediante microscopio óptico teniendo en cuenta parámetros importantes como el número de células, simetría, fragmentación y compactación celular, en unos tiempos determinados preestablecidos. Este método de evaluación presenta como limitaciones, no sólo la subjetividad del embriólogo sino también el propio sistema de evaluación, que concibe el desarrollo embrionario desde un punto de vista estático. Debido a la importancia de mantener a los embriones fuera del incubador el menor tiempo posible, por los efectos que tienen en los mismos los cambios en las condiciones de cultivo, las evaluaciones morfológicas se han limitado a tiempos concretos. La evaluación puntual del embrión, por tanto, se traduce en una enorme pérdida de información de todo lo que ocurre antes y después del momento analizado. Además, la rapidez con que se producen los cambios en la morfología celular puede implicar la pérdida completa de algunos procesos efímeros que se hacen evidentes cuando se visualiza todo el desarrollo embrionario. La solución a esta limitación implica la obtención de nuevas técnicas como la tecnología de time-lapse, capaz de registrar todo el desarrollo embrionario como un proceso dinámico (39). Esta tecnología puede mejorar los resultados de un ciclo de fecundación in vitro aumentando la capacidad para identificar y seleccionar embriones con un mayor potencial de implantación. Esto nos permitiría no solamente aumentar la tasa de implantación sino también realizar transferencias electivas de un solo embrión, reduciendo con ello los embarazos múltiples, uno de los grandes objetivos de la reproducción asistida. Ventajas principales: -Los embriones son analizados sin necesidad de sacarlos de su incubador. - Información objetiva y precisa, cualitativa y cuantitativa. Ventajas secundarias: - Ahorro de tiempo ya que no es necesario trasladar los embriones desde el incubador hasta el microscopio para su evaluación. - Disminución de los costes (medios de cultivo, placas, aceite mineral y CO2). - Ahorro de espacio, los incubadores que incorporan la tecnología time-lapse ocupan menos espacio físico en el laboratorio. - Introducción de nuevos parámetros, no solo morfológicos sino también dinámicos para la evaluación embrionaria. - Obtención de una gran cantidad de imágenes que son una fuente de información para futuros estudios retrospectivos. - Identificación de determinados fenómenos que sólo pueden detectarse a través de time-lapse, como por ejemplo la reabsorción de fragmentos. Un estudio llevado a cabo por Wong et al. utilizando un sistema time-lapse determinó varios tipos de divisiones aberrantes tales como citocinesis más largas de lo normal que originan una ligera fragmentación tras la división, comportamientos morfológicos raros varias horas antes de dividirse así como embriones que realizan varios intentos de división antes de dividirse completamente (41). Otro parámetro que también puede cambiar con el tiempo es la simetría de las blastómeras (33). Además, con la ayuda del time-lapse pueden excluirse embriones con patrones de división aberrantes que no podrían detectarse con evaluaciones en tiempos puntuales. El análisis de imágenes utilizando time-lapse también ha sido de gran utilidad para definir la duración de los primeros ciclos celulares, así como los tiempos entre dos divisiones consecutivas. Ciclos celulares extremadamente cortos pueden implicar una distribución anormal de ADN en las blastómeras o errores en la replicación (34). OBJETIVO El objetivo principal de este trabajo fue la validación de los algoritmos Eeva® y Xtend®, determinando si la categorización proporcionada se correlaciona con embriones con mayor potencial y nos pueden servir como criterio de selección embrionaria. MATERIAL Y MÉTODOS o Primera Parte Los embriones fueron cultivados en un incubador convencional con un sistema Eeva® integrado que incluye placas especiales con 12 micropocillos. Las placas se prepararon la tarde anterior y se dejaron en incubadores convencionales para pre-equilibrarse a 37ºC y con un 5% de CO2. Estas placas se rellenaron con medio de cultivo (Cleavage, COOK™, Sydney, Australia) tanto el pocillo central, que contiene los 12 micropocillos, como los 3 pocillos de lavado, y se cubrieron con 4 ml de aceite mineral para evitar la evaporación. Tras este pre-equilibrado, las burbujas de aire fueron retiradas de forma meticulosa antes de colocar los ovocitos. Una vez evaluada la fecundación, los cigotos se colocaron en la placa en un plazo de ≤20 horas post inseminación para evitar que comenzasen las primeras divisiones embrionarias, lo cual podría impedir el correcto análisis de las imágenes. En la siguiente imagen se muestra el modo correcto de colocación de la placa en el sistema que permite realizar el análisis de imágenes adecuadamente. La evaluación morfológica de los embriones en día 2 de desarrollo se realizó analizando las imágenes proporcionadas por el sistema, sin sacar los embriones del incubador. En día 3, se sacaron los embriones del incubador y se evaluaron bajo microcopio para su evaluación morfológica. Si la transferencia estaba programada para D5/6, a partir de D3 los embriones continuaron su cultivo en un incubador convencional en placas de cultivo convencionales (medio CCM, Vitrolife, Goteborg, Suecia). La selección de los embriones para transferencia se basó en una combinación de la información proporcionada por el sistema Eeva® y la evaluación morfológica convencional. o Segunda Parte Los embriones fueron cultivados en el incubador Geri+® (esta versión “plus” es la única que lleva incorporado el sistema de selección Eeva) que incluye placas especiales con 16 micropocillos. Se rellenaron con medio Gems (Genea Biomedx®, Sydney, Australia) tanto el pocillo central, que contiene los 16 micropocillos, como los 3 pocillos de lavado, y se cubrieron con 4 ml de aceite mineral para evitar la evaporación. Tras la microinyección, los ovocitos se colocaron directamente en la placa del Geri® y dentro de este incubador. La mitad de las cámaras del incubador se encontraban en condiciones de humedad mientras que la otra mitad proporcionaban un cultivo en ambiente seco. La evaluación morfológica de los embriones se realizó en D2 y D3 de desarrollo utilizando las imágenes proporcionadas por el sistema sin sacar en ningún momento los embriones del incubador. En estadío de blastocisto se combinó la información proporcionada por el sistema Eeva® junto con la evaluación morfológica convencional para realizar la selección embrionaria. Software del Sistema Eeva® y Algoritmos En día 3 de desarrollo, Eeva® calcula de forma automática los tiempos de las primeras divisiones, y utiliza su propio algoritmo para predecir la probabilidad de los embriones de alcanzar el estadío de blastocisto. La necesidad del uso de campo oscuro se debe a que el algoritmo detecta pixeles blancos sobre negros. De esta forma, la membrana plasmática queda destacada como un circulo blanco y por lo tanto cuando solo hay una célula esta línea no tiene intersecciones, cuando hay dos células tendrá 1 o dos puntos de intersección y así progresivamente. Además, Eeva® realiza fotos cada 5 minutos, y compara la última imagen con su anterior, basándose en el principio de que si dichos pixeles coinciden no se han producido cambios en el embrión mientras que en caso de que no haya coincidencia se debe a que puede haberse producido una división. El segundo parámetro que estudia para aumentar la precisión en la detección de divisiones son los cambios en la relación área-perímetro de los círculos, que son las blastómeras cuya ratio varía tras producirse una división. De esta forma, el sistema registra los tiempos exactos en los que se producen las primeras divisiones: t2, t3 y t4, calculando de forma automática los valores de P2 (t3-t2) y P3 (t4-t3). Por tanto, los tiempos utilizados para la clasificación son intervalos que no dependen de la hora en la que se ha realizado la microinyección, evitando el sesgo que implica utilizar ese punto de partida ya que no podríamos definir con precisión la hora exacta en la que se ha producido la microinyección de cada ovocito. Esta clasificación se basa en el estudio desarrollado por Wong en 2010 (41) en el que el tiempo entre la primera y segunda citocinesis (P2 (t3-t2)) y el tiempo entre la segunda y tercera citoquinesis (P3 (t4-t3)) destacaron en su modelo de predicción como parámetros más relevantes. En este estudio hemos utilizado dos algoritmos del sistema Eeva®. Tras varias versiones previas de mejora empezamos nuestro estudio utilizando la versión 2.2 y posteriormente la Xtend®. Versión 2.2 Los embriones se clasifican en tres categorías según su probabilidad de llegada a blastocisto.: HIGH (alto), MEDIUM (medio) y LOW (bajo) en función de los tiempos de P2 y P3. -Eeva® “High” (9.20 ≤ P2 ≤ 11.28 h; 0 ≤ P3 ≤ 1.44 h). -Eeva® “Medium” (9.20 ≤ P2 ≤ 12.39 h; P3: 0 ≤ P3 ≤ 4 h). -Eeva® “Low” (P2, P3, o ambos, fuera del rango óptimo de Eeva® “High” y “Medium”). Algoritmo Xtend® Para la elaboración de este nuevo algoritmo se llevó a cabo un riguroso proceso en el que se investigaron más de 1000 combinaciones con nuevos parámetros. De todos los parámetros analizados, destacaron 5 como más relevantes: • Edad del ovocito • P2 (t3-t2) y P3 (t4-t3) • Un análisis post-P3. Dicho análisis está relacionado con la textura o fragmentación del embrión (mide de forma cuantitativa cambios tenues en la uniformidad de la superficie del embrión). • Número de células en día 3 de desarrollo. En función de los valores de estas variables consideradas más relevantes, el sistema clasifica los embriones del 1-5, siendo 1 los embriones con más posibilidades de alcanzar el estadío de blastocisto. Conclusiones con los Resultados Obtenidos Algoritmo Eeva® - La tasa de llegada a blastocisto y de blastocisto de calidad óptima aumenta de forma estadísticamente significativa a medida que mejora la clasificación Eeva®. - El porcentaje de blastocistos viables es superior en D5 que en D6 de desarrollo, independientemente de la categoría. - La predicción de la llegada a blastocisto es más precisa utilizando la categorización Eeva® que la morfológica. - La tasa de implantación aumenta a medida que mejora la clasificación Eeva®, independientemente del día en el que se realice la transferencia. - La probabilidad de gestación al transferir al menos un embrión clasificado como “high” es mayor que en los casos en los que al menos uno de los embriones transferidos se categoriza morfológicamente como “A” (ASEBIR). Algoritmo Xtend® - La tasa de llegada a blastocisto y de blastocisto de calidad óptima aumenta de forma estadísticamente significativa a medida que mejora la clasificación Xtend®. - La tasa de implantación aumenta a medida que mejora la clasificación Xtend®. - En blastocistos óptimos, se mantiene esta correlación entre la tasa de implantación y la categoría Xtend® sin embargo en blastocistos que no se clasifican morfológicamente como “A” o “B” (ASEBIR) no existe correlación entre implantación y categorías Xtend®. - La incubación en cámaras con humedad dio lugar a un mayor porcentaje de embriones clasificados con las mejores categorías Xtend® comparado con la incubación en cámaras con ambiente seco. - El porcentaje de embriones biopsiables es mayor en las mejores categorías Xtend®. - No existe una correlación entre el porcentaje de embriones euploides y las categorías Xtend®. Discusión Es importante destacar que el time-lapse no supone una competición contra la morfología, pero nuestros resultados demuestran la habilidad de un software automatizado de evaluar la calidad embrionaria independientemente de su clasificación morfológica. Por último, podemos concluir que es incuestionable que la tecnología del time-lapse en el laboratorio de fecundación in vitro se está convirtiendo en una herramienta de gran utilidad que permite seleccionar embriones con mayor potencial de implantación y gracias a la cual estamos aprendiendo conceptos nuevos relacionados con la embriología. Los sistemas de clasificación automática Eeva® son la primera aplicación práctica de la inteligencia artificial a la rutina clínica. Con dos aproximaciones, la primera en el proceso de aprendizaje en el recuento de blastomeras del embrión basado en redes neuronales convolucionales y la segunda en el proceso de análisis post P3 realizado por el algoritmo Xtend® que mediante técnicas de “deep learning” analiza los cambios morfológicos del embrión durante 24 horas. Como futuros retos en este campo y como laboratorio pionero en la utilización de las últimas tecnologías, nos proponemos utilizar el algoritmo Xtend® para la selección embrionaria y seguir trabajando en el desarrollo y validación de nuevos algoritmos para que la fusión de todos ellos nos acerque cada día más a un algoritmo universal