Biotechnological platforms for aryl-alcohol oxidases by directed evolution

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 03-10-2019Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 03-04-2021The aryl-alcohol oxidase (AAO) is a fungal flavoenzyme that supplies H2O2 to the ligninolytic consortium during natural wood decay. Being active on a wide array of aromatic alcohols, this GMC oxidase presents a highly enantioselective mechanism of great interest in organic synthesis processes. The most powerful strategy for the AAO to meet industrial standards is the engineering of its properties by directed evolution. In the present Doctoral Thesis, an evolutionary platform for the AAO from Pleurotus eryngii was developed in order to: (i) obtain functional expression in yeasts, (ii) design a secondary benzyl-alcohol oxidase, and (iii) explore the enzymatic conversion of furfural derivatives. To achieve functional expression in Saccharomyces cerevisiae, the AAO gene was fused to different signal peptides including chimeric versions of the mating-α factor and the killer K1 toxin preprosequences. The platform for in vitro evolution was completed with a dual high-throughput screening assay to detect H2O2 that included a method based on the Fenton reaction. To enhance secretion, several libraries were created combining classical evolution (i.e. mutagenic PCR and DNA shuffling) with structure-guided evolution by MORPHING. The final secretion variant FX9, carried four mutations in the signal peptide and two substitutions in the mature protein including the consensus/ancestral H91N. The FX9 improved secretion up to 4.5 mg/L and presented high stability and kinetic values similar to the native enzyme. FX9 was cloned and expressed in Pichia pastoris maintaining expression levels and main biochemical properties. When the production was scaled-up in 5L fermenter, AAO production was increased to 25.5 mg/L. FX9 was further evolved to selectively oxidize secondary benzyl alcohols. The residual activity on chiral molecules was unlocked with the modulation for the catalytic pocket by combinatorial saturation mutagenesis. After four generations, that included a site-directed recombination step to polish mutations, LanDo variant harbored five new substitutions increasing the catalytic efficiency with 1-(p-methoxyphenyl)-ethanol in 3 orders of magnitude with a 99% ee. Exploring the transformation of 5-hydroxymethylfurfural (HMF) into furan-2,5-dicarboxylic acid (FDCA), FX9 acquired mutation F501W that improved catalytic efficiency on HMF 3-fold and showed for the first time the performance of three consecutive oxidations for the AAOLa aril-alcohol oxidasa (AAO) es una flavoenzima fúngica que suple H2O2 al consorcio ligninolítico durante la degradación natural de la madera. Siendo activa con una amplia variedad de alcoholes aromáticos, esta oxidasa GMC presenta un mecanismo altamente enantioselectivo de gran interés en procesos de síntesis orgánica. La estrategia más potente para adaptar a la AAO a estándares industriales es la ingeniería de sus propiedades mediante técnicas de evolución dirigida. En la presente Tesis Doctoral, una plataforma evolutiva para la AAO de Pleurotus eryngii fue desarrollada con el objetivo de: (i) obtener expresión funcional en levaduras, (ii) diseñar una aril-alcohol oxidasa activa con alcoholes secundarios, y (iii) explorar la conversión enzimática de derivados del furfural. Para obtener expresión funcional en Saccharomyces cerevisiae, el gen de la AAO se fusionó a diferentes péptidos señales incluyendo versiones quiméricas de las secuencias prepro del factor-α y la toxina killer K1. La plataforma para la evolución in vitro se completó con un ensayo dual de screening para la detección de H2O2 incluyendo un método basado en la reacción de Fenton. Para mejorar la secreción, se crearon varias librerías combinando evolución clásica (PCR mutagénica y DNA shuffling) con evolución focalizada con el método MORPHING. La variante final FX9, con alta estabilidad y constantes cinéticas similares a la enzima nativa, presentó cuatro mutaciones en el péptido señal y dos substituciones en la proteína madura incluyendo la consenso/ancestral H91N. FX9 se expresó en S. cerevisiae con valores de 4.5 mg/L y fue posteriormente clonada y expresada en Pichia pastoris a escala de fermentador de 5 L alcanzando niveles de secreción 25.5 mg/L y manteniendo sus propiedades bioquímicas generales. La variante FX9 fue sometida a posteriores ciclos de evolución, incluyendo el remodelado del bolsillo catalítico por mutagénesis saturada combinatorial, para la oxidación de alcoholes bencílicos secundarios. Las cinco mutaciones introducidas en la variante LanDo aumentaron la eficiencia catalítica con 1-(p-methoxyphenyl)-ethanol en 3 órdenes de magnitud con un 99 % ee. Explorando la transformación del 5-hydroxymethylfurfural (HMF) en furan-2,5-dicarboxylic acid (FDCA), FX9 adquirió la mutación F501W que mejoró 3 veces la eficiencia catalítica con HMF y demostró por primera vez la catálisis de 3 oxidaciones consecutivas para la AAOLa financiación que me ha permitido seguir mis estudios doctorales. Los proyectos europeos “Optimized oxidoreductases for medium and large scale industrial biotransformations (INDOX FP7-KBBE-2013-7-613549)” y “New enzymatic oxidation/oxyfunctionalization technologies for added value bio-based products. (ENZOX2 H2020-BBI-PPP-2015-2-720297)”. Los proyectos nacionales “Evolución dirigida de oxidoreductasas ligninolíticas modernas y ancestrales para el diseño de una levadura de podredumbre blanca (DEWRY BIO2013-43407-R)”, “Evolución dirigida y computacional de ligninasas (LIGNOLUTION BIO2016-79106-R)“ y “Química sintética mediante enzimas quiméricas de fusión diseñadas por evolución dirigida y computacional (EVOCHIMERA Y2018/BIO-4738)”