Fosfatase ácida da microalga Selenastrum capricornutum: extração, caracterização e efeito de poluentes de origem agrícola.

Selenastrum capricornutum é uma alga clorofícea unicelular mundialmente distribuída em corpos de água doce e solos. Devido à sua natureza cosmopolita, o seu uso em estudos de ecotoxicidade é recomendado por protocolos nacionais e internacionais. A fosfatase ácida de algas desempenha importantes funções metabólicas tais como decomposição de fosfato orgânico em fosfato inorgânico, processos autofágicos, reciclagem de material celular e formação do zigoto durante a reprodução. Agentes químicos introduzidos em compartimentos ambientais em decorrência da atividade agrícola, tais como agrotóxicos e contaminantes de lodo usado como fertilizante, podem alterar a atividade da enzima nesses produtores primários. No presente trabalho foram estudados a extração, estabilidade, especificidade por substratos, efeito de inibidores e cinética da fosfatase ácida do extrato bruto de Selenastrum capricornutum. Foi também avaliado o efeito in vitro de 30 poluentes de origem agrícola (24 orgânicos e 6 metais pesados), sendo que experimentos mais detalhados in vitro e estudos in vivo foram realizadoscom os agentes que promoveram maior efeito inibidor ou ativador. Os resultados demostraram que a extração foi aumentada pelo congelamento/descongelamento entre os ciclos de sonicação. a enzima apresentou atividade ótima de pH 5,0, um valor de km = 0,27 mM para o substrato p-NPP e mostrou-se estável após o armazenamento em freezer durante aproximadamente seis meses. A enzima foi inibida pelo tartarato (35%), fluoreto (755) e Pi (45%) e p-CMB (48%). Substratos orgânicos naturais como FMN, frutose 1,6 difosfato e alfa-glicero fosfato são clivados em um grau similar ao do substrato sintético p-NPP, sugerindo-se o possível envolvimento da enzima no metabolismo desses intermediários. Os resultados demonstraram que somente o surfactante alquil benzeno linear sulfonado (LAS) e os metais pesados Hg2+, Al3+ e Cu2+ produziram uma alteração marcante (>-50%) da atividade enzimática. A ordem de inibição da atividade na maior concentração testada foi LAS> Hg2+ = Al3+ > Se3+ = Pb2+ > cd2+. Os valores de concentração de inibição média (CI50) para Hg2+ e LAS foram, respectivamente, 0,085 e 0289 nM. Um mecanismo de inibição não-competitiva foi atribuído para o primeiro (Ki = 0,0365 mM), enquanto que o LAS comportou-se como um inibidor competitivo (Ki = 0,010 mM). Os estudos in vivo com culturas de algas tratadas 24 horas mostraram que a atividade enzimática e teor de proteína diminuíram os tratamentos com Hg2+, enquanto que aumentaram em exposições ao LAS. Diferentemente dos experimentos a curto prazo, a inibição da atividade específica foi observada nos organismos expostos durante 7 dias, sendo atribuído um valor de concentração efetiva média (CE50) equivalente a 12,63 microM de Hg2+ e uma redução de 39% para LAS 2 mM. Os resultados de experimentos in vitro com Cu2+, como um ativador da fosfatase ácida, demonstraram uma EC50 e uma KdCu2+ (constante de dissociação para Cu2+) equivalente a 1,80 e 1,64 microM, respectivamente. Quando a enzima foi pré-incubada na presença de Cu2+ 0,2 mM, a Km e a Ea (energia de ativação) diminuíram enquanto que a Vmax praticamente não alterou. De acordo com os dados de estabilidade em função do tempo e de experimentação em condições de pré-incubação, sugere-se que o efeito ativador do cobre seja devido ao aumento da estabilidade térmica da enzima. Nas exposições in vivo das culturas de S. capricornutum ao Cu2+, nas concentrações de 1 e 10 mM, foram obtidas diminuições significativas da atividade da fosfatase ácida e da concentração de proteína, entretanto estes efeitos não foram observados na concentração de 0,1 mM. o íon metálico não alterou a atividade específica da enzima nas condições de exposição testadas. Os estudos sobre a ação conjunta inibidora indicaram que o Hg2= possui menor valor de CI50 que o Al3+ ou LAS; e que as misturas Hg2+ + Al3+ e Hg2+ + LAS possuíam, respectivamente, efeito aditivo e levemente antagônico. O Cu2+, que demonstrou ter efeito ativador quando pré-incubado com a enzima, comportou-se como um leve antagonista contra o efeito inibidor do Hg2+. Espera-se que os resultados do presente trabalho auxiliem no delineamento experimental e discussão de resultados em estudos com enzimas de algas ou outros organismos, no que se refere à sua extração, caracterização e efeitos de agentes químicos. espera-se ainda que os resultados melhorem o entendimento dos eventos básicos sobre o impacto de poluentes de origem agrícola em níveis bioquímicos de produtores primários.Tese (Doutorado em Biologia Funcional e Molecular) - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas