Nanostructured surfaces for electrochemical sensors and biosensors and applications

Tese no âmbito do Doutoramento em Química, Ramo de Especialização em Eletroquímica e apresentada ao Departamento de Química da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.O principal objetivo deste estudo foi desenvolver novos sensores e biossensores eletroquímicos com propriedades analíticas melhores pelo uso de diferentes nanomateriais condutores e mediadores redox para a modificação de elétrodos, além de seu uso como elétrodo suporte para a imobilização de enzimas. Alguns dos aspetos mais relevantes na fabricação de sensores e biossensores eletroquímicos estão focados, o estado da arte em relação aos nanomateriais condutores, aos nanomateriais nanoestruturados como modificadores de elétrodos, e sobre as enzimas. Os principais fundamentos teóricos das técnicas eletroquímicas utilizadas, nomeadamente a voltametria cíclica, a voltametria de impulso diferencial e a espectroscopia de impedância eletroquímica também são descritos, bem como outras técnicas utilizadas para a caracterização das nanoestruturas, nomeadamente a microscopia eletrónica de varrimento, a microscopia eletrónica de transmissão e a difração de raios-X. Um sensor eletroquímico de fácil fabricação para a determinação de teofilina foi desenvolvido baseado em uma nova plataforma preparada pela fixação direta de nanopartículas de ouro numa rede de nanotubos de carbono de paredes múltiplas, que foi depositado sobre um elétrodo suporte de carbono vítreo. Para este efeito, os nanotubos de carbono funcionalizados dispersos em quitosana foram misturados coma uma solução coloidal de nanopartículas de ouro. As técnicas de voltametria cíclica, voltametria de impulso diferencial e espectroscopia de impedância eletroquímica foram utilizadas para caracterizar os sistemas. Sob condições experimentais otimizadas, a plataforma com as melhores propriedades sensoriais foi utilizada para a determinação de teofilina, com um limite de detecção de 90 nM. Numa segunda fase, novos sensores eletroquímicos para a detecção da tiramina, uma amina biogénica comumente encontrada em alimentos fermentados, foram desenvolvidos. Nanopartículas de ouro preparadas por um novo método de síntese verde foram misturadas com um derivado da anilina, o 8-anilino-1-naftaleno- ácido sulfónico. Eletropolimerização potenciodinâmica levou à formação de um filme polimérico com nanopartículas de ouro encapsuladas e estabilizadas, por este método simples e eficiente. Elétrodos modificados com o filme nanocompósito foram utilizados para a monitorização da tiramina por duas metodologias electroanalíticas. Na primeira, um sensor impedimétrico sensível usando um filme do polímero dopado com nanopartículas de ouro eletrodepositados sobre um elétrodo suporte de ouro foi desenvolvido. A segunda consistiu no desenvolvimento de um biossensor amperométrico com a enzima tirosinase imobilizada sobre o filme nanocompósito de polimero dopado com nanopartículas de ouro em elétrodo suporte de carbono vítreo. Ambos os tipos de sensores foram testados para a determinação de tiramina e demonstraram excelentes parâmetros analíticos. Os limites de detecção foram estimados em 0,04 µM e 0,71 µM para o sensor impedimétrico e o biossensor, respectivamente. Os limites de detecção obtidos foram similares a arquiteturas de elétrodo mais complexas encontradas na literatura. Um biossensor de inibição enzimática empregando poli(verde brilhante) como mediador foi desenvolvido para a determinação de vestígios de iões metálicos biotóxicos, Hg2+, Cd2+, Pb2+ e CrVI, por inibição enzimática. Filmes de poli (verde brilhante) foram preparados por eletropolimerização potenciodinâmica no solvente eutético etalina com adição de ácido dopante depositados sobre elétrodos de carbono vítreo modificados por nanotubos de carbono de paredes múltiplas; o melhor ácido dopante encontrado foi o ácido sulfúrico. A glucose oxidase foi imobilizada sobre estas superfícies e o novo biossensor foi utilizado com sucesso para a determinação de vestígios de catiões metálicos biotóxicos, com limites de detecção nanomolares e inferiores aos descritos na literatura, aproximadamente 2 nM para todos os iões metálicos. O mecanismo de inibição enzimática reversível foi investigado. A tinta fenazínica azul de cresil brilhante também foi eletropolimerizada no solvente eutético etalina sobre elétrodos de carbono vítreo modificados por nanotubos de carbono de paredes múltiplas, em diferentes condições experimentais de acido dopante, pH e modo de deposição (potenciostática ou potenciodinâmica). Sob as melhores condições experimentais, o novo filme nanocompósito desenvolvido foi testado como electrodo suporte para a imobilização das enzimas glucose oxidase, tirosinase e colina oxidase, apresentando excelente desempenho como biosensores para a determinação de glicose, catecol e colina e para o pesticida diclorvos (este por inibição da colina oxidase), respectivamente. Os limites de deteção obtidos foram de 2,6 µM, 3,9 µM, 1,55 µM e 1,6 nM, respectivamente. Estes limites de detecção baixos demonstram que o novo filme nanocompósito proposta é muito promissor para futuras aplicações em biossensores eletroquímicos enzimáticos. As conclusões resumem os principais resultados obtidos e vantagens das plataformas utilizadas como sensores e biosensores baseadas em superfícies nanoestruturadas desenvolvidas neste trabalho. Alguns tópicos importantes e direções futuras relacionados com este trabalho são indicados.The main goal of this study was to develop novel electrochemical sensors and biosensors, with improved analytical properties, by using different conducting nanomaterials and redox mediators for electrode surface modification and as electrode support for enzyme immobilisation. An overview is given of some relevant aspects in the fabrication of electrochemical sensors and biosensors, the state-of-the-art regarding conducting nanomaterials and nanostructured materials as electrode modifiers, and concerning enzymes. The basis of the electrochemical techniques used, namely cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy are described, as well as other techniques used for characterisation of the nanostructures, namely scanning electron microscopy, transmission electron microscopy, and X-ray diffraction. An easy to prepare electrochemical sensor for theophylline determination was developed based on a novel platform prepared by direct attachment of gold nanoparticles on a multi-walled carbon nanotube network, which was then deposited on a glassy carbon electrode support. For this purpose, functionalised multi-walled carbon nanotubes dispersed in chitosan were mixed with gold nanoparticle colloidal solution. Cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, and electrochemical impedance spectroscopy were used to characterise the systems. Under the best experimental conditions, the platform with the best sensing properties was used for theophylline determination, with a detection limit of 90 nM. Secondly, new electrochemical sensors were developed for the determination of tyramine, a biogenic amine commonly found in fermented food. Gold nanoparticles prepared by a new, green synthetic route were mixed with the aniline derivative 8-anilino-1-naphthalene sulphonic acid. Potential cycling electropolymerisation led to a polymer film with encapsulated and stabilised gold nanoparticles, by this simple and efficient method. The nanocomposite film modified electrodes were used for monitoring of tyramine, by two electroanalytical approaches. In the first, a sensitive impedimetric sensor using the gold nanoparticle doped-polymer film on a gold electrode support was developed. The second consisted of the development of an amperometric biosensor with the enzyme tyrosinase immobilised on a gold nanoparticle doped-polymer nanocomposite film modified glassy carbon electrode. Both types of sensor were tested for tyramine determination and showed excellent analytical parameters. The detection limits were estimated to be 0.04 µM and 0.71 µM for the impedimetric sensor and the biosensor, respectively. The detection limits obtained were similar to more complex architectures found in the literature. An enzyme inhibition biosensor employing poly(brilliant green) as mediator was developed for the determination of the biotoxic trace metal ions, Hg2+, Cd2+, Pb2+, and CrVI, by enzyme inhibition. Poly(brilliant green) films were formed by potential cycling electropolymerisation in ethaline–deep eutectic solvent with added acid dopant on multi-walled carbon nanotube modified glassy carbon electrodes; the best acid dopant was found to be sulfuric acid. Glucose oxidase was immobilised on these surfaces and the novel biosensor was successfully used for the determination of biotoxic trace metal cations with lower nanomolar detection limits than reported in the literature, around 2 nM for all trace metal ions. The mechanism of reversible enzyme inhibition was probed. The phenazine brilliant cresyl blue was also electropolymerised in ethaline deep eutectic solvent on multi-walled carbon nanotube modified glassy carbon electrodes, under varying experimental conditions of acid dopant, pH, and deposition mode (potentiostatic or potentiodynamic). Under optimal conditions, the novel nanocomposite film developed was tested as electrode support for glucose oxidase, tyrosinase, and choline oxidase immobilisation, presenting excellent biosensing performance for glucose, catechol, and choline and dichlorvos pesticide (this by choline oxidase inhibition) determination, respectively. The detection limits obtained were 2.6 µM, 3.9 µM, 1.55 µM and 1.6 nM, respectively. These low detection limits demonstrate that the novel nanocomposite film proposed is very promising for future applications in electrochemical enzyme biosensors. The conclusions summarise the main achievements and advantages of the sensing and biosensing platforms based on nanostructured surfaces developed in this work. Some important topics and future directions related to this work are indicated