Compreensão dos mecanismos subjacentes que regulam o envelhecimento e a longevidade

Tese de Doutoramento apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra (IIIUC) para prestação de provas necessárias à obtenção do grau de Doutor em Biologia Experimental e Biomedicina (ramo Biologia Molecular, Celular e do Desenvolvimento)O envelhecimento é caracterizado por uma perda progressiva da função dos vários órgãos, resultando num maior risco de morte devido a várias doenças. Doenças crónicas relacionadas com a idade, como diabetes mellitus tipo II, doenças neurodegenerativas, cancro e doenças cardiovasculares, estão entre as principais causas de morbidade e morte no mundo. Nas últimas décadas foram alcançados importantes avanços na área, em particular com a descoberta de que o ritmo de envelhecimento é coordenado, pelo menos em parte, por vias genéticas e processos bioquímicos conservados. Estudos em leveduras levaram à descoberta de uma dessas vias, uma família de enzimas conservadas, conhecidas como as sirtuínas. As sirtuínas (SIRT1-7) são uma família de deacetilases dependentes do dinucleótido de nicotinamida e adenina (NAD+ ) com capacidades extraordinárias para prevenir doenças e até mesmo reverter alguns aspectos do envelhecimento. Em particular a SIRT1, a sirtuína mais estudada da família, demonstrou ter um papel fundamental na regulação do metabolismo, reparação do DNA, inflamação, estrutura da cromatina assim como o envelhecimento em mamíferos. A descoberta de que o resveratrol e outras moléculas derivadas de plantas, conhecidas como STACs (compostos de ativação de SIRT1), tinham a capacidade de ativar a SIRT1 in vitro e in vivo, proporcionaram uma procura de ativadores desta enzima, com o objetivo de estudar os seus benefícios para a saúde. No entanto, continua por desvendar se as STACs como o resveratrol e o SRT1720 medeiam os seus benefícios através da ativação direta da SIRT1. Com o objetivo de abordar esta questão, produzimos um modelo animal, um mutante homozigoto para E222K (SIRT1-E222K), com uma ativação defectiva na SIRT1, que não responde à ativação de STACs in vitro. Deste modo, este modelo animal permitiu-nos determinar quais dos efeitos benéficos do resveratrol são devidos à direta ativação da SIRT1. Neste trabalho demonstramos que o resveratrol, adicionado à dieta dos animais, aumentou significativamente a sobrevivência de WT, mas não dos animais portadores da mutação E222K, quando estes foram alimentados com uma dieta rica em gordura. A adição de resveratrol à dieta do animal resultou numa melhoria geral da sua saúde levando a uma maior longevidade. Igualmente verificámos uma redução da patologia hepática, um aumento da sensibilidade à insulina, uma maior resistência e atividade locomotora, assim como uma normalização dos indicadores de inflamação. Para além das STACs tradicionais, uma nova classe de compostos começou a ser recentemente explorada. Estudos em leveduras mostraram que estes compostos aumentam a via de reciclagem de NAD, que recicla NAD+ a nicotinamida (NAM), prolongando a longevidade e mimetizando os benefícios de restrição calórica. Esta descoberta levou os investigadores a testar moléculas capazes de restabelecer os níveis de NAD+ . Este trabalho teve como objetivo explorar a possibilidade de testar várias intervenções genéticas através de estratégias sinérgicas para assim estudar doenças relacionadas com a idade e o XVI envelhecimento. Depois de aumentar a expressão génica e a atividade das sirtuínas, observámos que o tratamento com mononucleotídeo de nicotinamida (NMN) evitou a perda de peso dos animais relacionada com a idade, com um aumento não significativo na longevidade (p=0,15). O trabalho realizado com as sirtuínas, através do aumento da sua atividade ou da sua expressão génica, demonstrou ser fundamental para se perceber como tratar de uma só vez todas as doenças associadas com a idade, e assim ajudar a aumentar o tempo de vida e a saúde dos idosos. A complexidade das doenças, a necessidade de compreender como retardar o processo de envelhecimento e de descubrir novas terapias, faz com que seja fundamental o desenvolvimento de modelos animais que melhor mimetizem doenças relacionadas com a idade. Estudos anteriores demonstraram que “RCM” (relocalização de modificadores de cromatina), é uma causa importante para o envelhecimento em mamíferos. Neste trabalho desenvolvemos um novo modelo animal, “ICE” (para mudanças indizíveis no epigenoma), que nos permitiu induzir cortes no DNA, em regiões não-codificadoras do genoma dos animais. De acordo com a hipótese RCM, o rato ICE exibiu fenótipos relacionados com uma idade avançada, assim como doenças relacionadas com a mesma. Estes resultados demonstraram que mudanças epigenéticas, associadas ao processo de reparação do DNA, são a causa do envelhecimento em mamíferos. Estes resultados criam uma melhor compreensão sobre os mecanismos fundamentais de ativação alostérica de enzimas complexas, assim como os meios para testar múltiplas intervenções genéticas para promover a saúde e a longevidade. Desta forma, estamos mais perto de determinar quais as doenças que as STACs poderão tratar em humanos e como poderemos melhorar a sua potência. Finalmente, acreditamos que o modelo ICE será uma ferramenta importante para estudar doenças humanas e avaliar se o processo de envelhecimento pode ser retardado ou revertido usando novos ou conhecidos compostos.Aging is accompanied by a progressive loss of healthy function in multiple organ systems, leading to impaired function and increased vulnerability to death from multiple diseases. Chronic, age-related diseases, such as type II diabetes mellitus, neurodegenerative diseases, cancers, and cardiovascular diseases are already among the leading causes of morbidity and death in the world. Unprecedented advances have been achieved in the aging field in the last decades, particularly with the discovery that the rate of aging is coordinated, at least in part, by genetic pathways and conserved biochemical processes. Historically, however, researchers have focused their attention on investigating individual pathways in isolated organs as a strategy to unravel the root cause of aging, with the ultimate goal of designing better drugs. Studies in yeast led the discovery of one of these pathways, a family of conserved enzymes, known as the sirtuins. The sirtuins (SIRT1-7) are a family nicotinamide adenine mononucleotide (NAD+ )-dependent deacetylases with extraordinary abilities to prevent diseases and even revert some aspects of aging. Importantly, SIRT1, which is the most studied sirtuin of the family, has been shown to play a key role in the regulation of metabolism, DNA repair, inflammation, chromatin structure, and aging in mammals. The discovery that resveratrol and other plant-derived molecules, known as STACs (for SIRT1 activating compounds), could activate SIRT1 in vitro and in vivo led the field to seek for SIRT1 activators and study their potential health benefits. However, whether STACs such as resveratrol and SRT1720 mediate their health benefits via direct SIRT1 activation remains an unsolved question in the field. In order to address this major question, we have generated a knock-in mouse model that is a homozygous mutant for E222K (SIRT1-E222K), an activating-defective mutant, shown not to respond to STACs activation in vitro, and we used it to precisely determine which of the biological effects of resveratrol are due to SIRT1 activation. Here, we show that resveratrol significantly increased survival of wild-type (WT) mice, but not of mice carrying the E222K mutation when fed a high-fat diet. Resveratrol produced changes associated with longer lifespan, reduced liver pathology, increased insulin sensitivity, enhanced endurance and locomotor activity, as well as normalized markers of inflammation (Baur et al., 2006). In addition to traditional STACs, a newer class of compounds is gaining attention in the field. Up-regulation of the NAD salvage pathway, which recycles NAD+ from nicotinamide (NAM), was shown to extend lifespan and mimic caloric restriction (CR) in yeast. This discovery drove the field to test molecules that restore NAD+ levels in elderly individuals. Herein, we tested if synergistic strategies accelerate the ability to test multiple genetic interventions, to study aging and age-related diseases. We tested the effects of boosting gene expression and activity of the entire sirtuin gene family and observed that (nicotinamide mononucleotide) NMN supplementation protected against age-related decreases in body weight, with a non-significant increase in longevity (p=0.15). XX Prior research in the sirtuin field was critical to understanding how treating all ageassociated diseases at once, whether by boosting sirtuin activity or their expression, could help increase lifespan and healthspan of the elderly. However, in order to fully understand the best approaches to slow down the aging process and develop therapies for age-related diseases, there has been need to develop mouse models that better recapitulate human-like age-related diseases (Justice and Dhillon, 2016). Accumulating evidence shows that an epigenetically-driven process, called “RCM” (relocalization of chromatin factors), is an important cause of aging in mammals (Vijg and Hasty, 2006). Here, we have developed a novel animal model called the “ICE mouse” (for inducible changes in epigenome) that has allowed us to induce a few DNA cuts in non-coding regions of the mouse genome across all tissues and monitor the effects on key tissues and age-related physiology. In agreement with the RCM hypothesis, the ICE mouse exhibited early onset of age-related phenotypes, as well as of age-related diseases. These results are consistent with the epigenetic shift driven by the DNA repair process as being an upstream cause of aging in mammals. Together, the results presented herein provide insights into the fundamental mechanisms of allosteric activation of complex enzymes and the means to test multiple genetic interventions to promote healthspan and longevity. In this way, we are closer to determine which diseases STACs could treat in humans and how they can be improved to increase their potency. Finally, we envision that the ICE model will be a novel tool used to model human diseases and assess whether the aging process can be slowed down or reverted using known and novel agents