Research of Pathogenicity Factors of Escherichia coli isolated from Foodstuffs and Food Production Environments

Dissertação de Mestrado em Segurança Alimentar apresentada à Faculdade de FarmáciaEscherichia coli faz parte da microbiota do trato intestinal de organismos de sangue quente. No entanto, algumas estirpes possuem fatores de virulência que afetam processos celulares nos humanos causando doenças do trato gastrointestinal (e extraintestinal). As estirpes enteropatogénicas são classificadas com base nos seus mecanismos de patogenicidade, local e mecanismo de aderência, da seguinte forma: E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli verotoxigénica/produtora de Shiga toxina (VTEC/STEC), entre outras. As estirpes são transmitidas maioritariamente via fecal-oral, através da ingestão de produtos contaminados, água ou alimentos, devido às más práticas agrícolas, e más práticas de higiene e de fabrico na produção e distribuição alimentar. Os métodos fenótipos são frequentemente utilizados para o isolamento e a identificação do patotipo é confirmada por métodos moleculares, através da deteção de genes de virulência específicos. De forma a isolar e detetar estirpes patogénicas de E. coli em alimentos para consumo humano, o principal objetivo deste trabalho foi montar um protocolo para a deteção de fatores de virulência de E. coli patogénicas, que possa ser usado na rotina laboratorial, por PCR convencional e, sempre que possível, em PCR multiplex, que permite num só ensaio detetar simultaneamente vários genes, e consequentemente identificar com maior rapidez a estirpe. O método por PCR é mais rápido, tem menores custos e apresenta alta sensibilidade e especificidade. Propus-me a otimizar as condições da PCR para deteção de 11 genes de virulência de cinco patotipos diferentes:• EAEC: genes pCVD432, astA, aggR e/ou aaiC;• EIEC: gene ipaH;• EPEC: genes eae e/ou bfpA;• ETEC: genes eltB e/ou estA;• VTEC/STEC: genes stx1 e/ou stx2.O isolamento e identificação do patotipo permitirá a análise filogenética e a investigação de surtos, o que poderá permitir estabelecer uma relação entre uma toxinfeção alimentar e o género alimentício que a provocou.O trabalho experimental foi iniciado pela otimização de condições de extração de ADN em estirpes padrão, e posteriormente, nas amostras. O processo de otimização da PCR foi complexo tendo-se feito vários ensaios com variação das condições de PCR, nomeadamente, o tempo de emparelhamento e/ou o tempo da extensão, a temperatura de emparelhamento, a concentração de primers e a concentração de ADN na mistura da PCR, de forma a obter os produtos amplificados esperados. Foi possível otimizar individualmente a PCR para 10 dos 11 genes (dos quais não se conseguiu otimizar as condições para o gene bfpA). Conseguiu-se otimizar uma PCR multiplex para os genes característicos de E. coli verotoxigénica/produtora de Shiga toxina: stx1 e stx2. Das amostras estudadas (n=100), e tendo sido realizadas “pools” de 10 amostras, encontrou-se uma baixa percentagem de genes de virulência e diversidade de patotipos: 6% EAEC e 1% ETEC. O gene mais frequentemente encontrado foi o astA (6%) da EAEC. Todos os genes detetados estavam presentes em alimentos crus ou que podem ter sido adicionados pós-processamento pelos manipuladores de alimentos com as mãos. Apesar dos resultados não serem alarmantes, indicam a presença de patotipos associados a reservatórios humanos em alimentos prontos para consumo e por isso, deve-se continuar a monitorizar a presença de patotipos de E. coli em géneros alimentícios e as suas vias de transmissão de forma a efetivar ações de melhoria que promovam a Segurança Alimentar. Deve-se continuar a alertar a população e, em especial, os manipuladores de alimentos, para os riscos da contaminação de alimentos, principalmente os que serão consumidos crus, com bactérias de origem fecal. Este trabalho poderá contribuir em prol da Saúde Pública visto que a identificação dos diferentes patotipos de E. coli pode contribuir para detetar potenciais reservatórios, fontes de contaminação e vias de transmissão, para além de poder contribuir também para a instituição de medidas de controlo imediatas e para a prevenção, através de vacinas e novos tratamentos, de doenças diarreicas provocadas por E. coli.Escherichia coli is part of the microbiota of the intestinal tract of warm-blood organisms. However, some strains express virulence factors that affect cellular processes in humans causing diseases of the gastrointestinal (and extraintestinal) tract. Enteropathogenic strains are classified based on their pathogenicity mechanisms, local and mechanism of adherence, as follow: enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), enteroaggregative E. coli (EAEC) and E. coli verotoxigenic/Shiga toxin producing (VTEC/STEC), among others. The strains are mostly transmitted via faecal-oral, through the ingestion of contaminated products, water or food, due to bad agricultural practices, and bad hygiene and manufacturing practices in food production and distribution. Phenotype methods are often used for the isolation and the patothype is confirmed by molecular methods, through the detection of specific virulence genes. In order to isolate and detect pathogenic strains of E. coli in food for human consumption, the main objective of this work was to set up a protocol for the detection of pathogenic E. coli virulence factors that can be used in the laboratory routine by conventional PCR and, whenever possible, multiplex PCR, which allows in a single assay to simultaneously detect several genes, and consequently to identify the strain. PCR is faster, has lower costs and has high sensitivity and specificity. I proposed to optimize the conditions by conventional PCR for the detection of 11 virulence genes from five different pathotypes:• EAEC: genes pCVD432, astA, aggR and/or aaiC;• EIEC: gene ipaH; • EPEC: genes eae and/or bfpA;• ETEC: genes eltB and/or estA;• VTEC/STEC: genes stx1 and/or stx2.The isolation and identification of the pathotype will allow phylogenetic analysis and outbreaks investigation, which may allow stablishing a relationship between a food infection and the foodstuff that caused it.The experimental work was initiated by the optimization of DNA extraction conditions in standard strains, and later in the samples. The PCR optimization process was complex with several studies with variables of the PCR conditions, namely, annealing time and/or extension time, annealing temperature, primer concentrations and DNA concentration at mixing the PCR to obtain the amplified products expected. It was possible to optimize the PCR for 10 of the 11 genes (from which the conditions for bfpA gene could not be optimized) individually. It was possible to optimize a multiplex PCR for the characteristic genes of E. coli verotoxigenic/Shiga toxin producing: stx1 and stx2.From the samples studied (n=100), and having pools of 10 samples, a low percentage of virulence genes and diversity of pathotypes was found: 6% EAEC and 1% ETEC. The gene most frequently found was astA (6%) from EAEC. All detected genes were present in raw foods or that may been added post-processing by hand good handlers.Although the results are not alarming, they indicate the presence of pathotypes associated with human reservatoirs in ready-to-eat food and therefore, the presence of E. coli pathotypes in foodstuff and their transmission routes and alert for the improvement actions that promote Food Safety. The population and, in particular, food handlers should continue to be alerted for the risks of food contaminations, especially those that will be eaten raw with faecal bacteria. This work may contribute to Public Health since the identification of the different E. coli pathotypes can contribute to detect potential reservatoirs, sources of contamination and transmission routes, as well as to contribute to the stablishment of immediate control measures and for the prevention, through vaccines and new treatments, of diarrheal diseases caused by E. coli