Entrega direcionada de combinações de doxorrubicina e ceramida-C6 a células de cancro do pulmão de não-pequenas células

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaO cancro é, atualmente, a doença responsável pela segunda maior taxa de mortalidade a nível mundial. Entre todas as doenças oncológicas, o cancro do pulmão é o mais frequente e o mais fatal, por isso, representa uma necessidade médica relevante.Embora existam estratégias terapêuticas inovadoras para cancro do pulmão introduzidas recentemente, como os inibidores de tirosina cinase e os agentes anti-angiogénicos, a sua eficácia não é isenta de fenómenos de resistência. Para além disso, a quimioterapia convencional recorrendo a fármacos com elevado potencial citotóxico, quer individualmente ou em combinação, embora muitas vezes eficaz, também apresenta limitações: a toxicidade em tecidos saudáveis (responsável por efeitos secundários nefastos para o doente) ou a dificuldade em fazer chegar rácios farmacologicamente vantajosos ao tumor (devido às suas diferentes características farmacocinéticas). Neste contexto, torna-se relevante o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas que simultaneamente ultrapassem a resistência a fármacos inerente à heterogeneidade tumoral, atingindo diferentes populações celulares do tumor, e reduzam os efeitos secundários sobre tecidos saudáveis.O presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de uma nova estratégia terapêutica contra o cancro do pulmão de não-pequenas células (CPNPC), o subtipo mais frequente de cancro do pulmão. A estratégia consiste em lipossomas sensíveis ao pH, PEGuilados, contendo combinações de doxorrubicina (inibidor da topoisomerase II) e ceramida-C6 (inibidor pró-apoptótico da via PI3K/Akt) e direcionados, pelo peptídeo F3, para a nucleolina, uma proteína que se encontra sobreexpressa na membrana celular das células tumorais e endoteliais do microambiente tumoral. Neste estudo, demonstrou-se que, através do ajuste rigoroso das condições de pH, a produção de lipossomas sensíveis a pH, contendo ceramida-C6 na bicamada lipídica, é exequível em condições acídicas moderadas sem interferir com as suas propriedades físicas básicas. Além disso, foi demonstrado que lipossomas funcionalizados com o peptídeo F3 se associam, pelo menos, 51 vezes mais com as células de CPNPC em comparação com os não direcionados. Apesar desta observação, os lipossomas funcionalizados com peptídeo F3 encapsulando uma combinação de doxorrubicina e ceramida-C6 não permitiram um aumento da citotoxicidade contra as linhas celulares de CPNPC (A549 e H1975), ao contrário do que se observou anteriormente em cancro da mama triplo negativo. Esta observação correlacionou-se com um impacto reduzido na desregulação dos níveis de fosforilação de Akt e, consequentemente, na inibição da cascata de sinalização a esta associada. Por outro lado, as células de CPNPC exibiram uma maior ativação basal de Akt em comparação com as linhas celulares de cancro da mama, o que as favoreceu em termos de resistência à ação da ceramida-C6. De um modo geral, o conhecimento gerado no presente trabalho sugere que o potencial citotóxico da ceramida-C6, em combinação com doxorrubicina e direcionada para a nucleolina, pode depender da ativação constitutiva da via de sinalização PI3K/Akt em células de diferentes origens histológicas, independentemente dos níveis de nucleolina na superfície celular e consequente internalização das nanopartículas.Globally, cancer is the second leading cause of mortality and, among all malignant neoplasms, lung cancer is the most common and fatal disease, thereby representing an urgent medical need.Despite the development of innovative therapeutic approaches such as tyrosine kinase inhibitors and anti-angiogenic therapies, their efficacy is restricted by the emergence of drug resistance phenomena in lung cancer. Moreover, although often effective, standard chemotherapy using potent cytotoxic drugs, as single or combined agents, presents limitations. The undesired toxicity to healthy tissues (causing serious side effects) and the difficulty to delivery synergistic ratios of drug combinations to the tumor (due to the differences in the pharmacokinetics properties of the drugs) are some of the major challenges associated with standard chemotherapy strategies. In this context, it is relevant to develop innovative therapeutic approaches capable of bypassing drug resistance mechanisms, by affecting diverse cellular populations in the tumor microenvironment, while reducing the side effects in normal tissues.The present work aimed at evaluating the cytotoxic potential of a new therapeutic strategy towards non-small cell lung cancer (NSCLC), the most frequent subtype of lung cancer. The strategy is based on PEGylated pH-sensitive liposomes, containing combinations of doxorubicin (topoisomerase II inhibitor) and C6-ceramide (pro-apoptotic inhibitor of the PI3K/Akt pathway), and targeted by the F3 peptide to nucleolin, a protein which is overexpressed in the cell membrane of cancer and endothelial cells of the tumor microenvironment. Herein, it was demonstrated that fine tuning of pH conditions enables the manufacturing of pH-sensitive liposomes containing C6-ceramide in the lipid bilayer in mildly acidic conditions, without impact on basic physical properties. Furthermore, it was demonstrated that F3 peptide-targeted liposomes associated, at least, 51-fold higher with NSCLC cells, compared to the non-targeted counterpart. Despite this observation, the F3 peptide-targeted liposomes containing a combination of doxorubicin and C6-ceramide did not enable an increase in cytotoxicity against A549 and H1975 NSCLC cell lines, in contrast with previous observation in triple negative breast cancer. This observation correlated with the limited impact on the deregulation of phosphorylated Akt (p-Akt) levels, and thus consequent downregulation of the associated signaling pathway. Alongside, data demonstrated NSCLC cell presented higher basal Akt activation compared with breast cancer cell lines, favoring the former in terms of resistance to C6-ceramide action. Overall, the data generated herein suggested that the cytotoxic potential of C6-ceramide, in combination with doxorubicin, and targeted to nucleolin may depend on the constitutive activation of PI3K/Akt signaling pathway across histological origins, and independently of the nucleolin levels at cell surface and consequent internalization of the nanoparticles.Outro - This work was supported by the European Regional Development Fund (ERDF), through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projects Cancel Stem (reference POCI-01-0145-FEDER-016390), CENTRO-01-0145-FEDER-000012 (HealthyAging2020), Euronanomed 2 (FCT reference ENMed/0005/2015)" and CNC.IBILI (FCT reference UID/NEU/04539/2019)