Alfa-SINUCLEINA EM VESICULAS EXTRACELULARES

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de FarmáciaA Doença de Parkinson (DP) é a mais comum doença neurodegenerativa domovimento, afetando aproximadamente 4 milhões de pessoas em todo o mundo. Écaracterizada pela degeneração progressiva e consequente subatividade do sistemanigrostriatal dopaminérgico, responsável pela coordenação motora. Devido a essascaracterísticas fisiopatológicas, os sintomas motores clínicos da DP variam entre rigidezmuscular a acinesia, tremor de repouso, instabilidade postural e, ulteriormente, emvários sintomas não motores.As inclusões intracelulares de α-sinucleína agregada (α-Syn) na forma de corpos deLewy (LBs) são a principal característica identificativa desta doença. O mecanismo peloqual a α-Syn provoca os seus efeitos neurotóxicos ainda não está totalmente elucidado.Existem algumas evidências que sugerem que espécies oligoméricas de α-Syn poderãopossivelmente ser importantes indutores de toxicidade e também desempenhar umpapel na disseminação da patologia pelo SNC. No entanto, existe ainda uma panópliade questões a serem respondidas: Qual o mecanismo responsável pela disseminaçãoda α-Syn pelo cérebro? Como é que α-Syn internalizada induz patologia em célulasrecetoras saudáveis?Evidências recentes sugerem que as vesículas extracelulares (VEs) poderão estarassociadas à propagação intercelular de α-Syn em todo o SNC. Adicionalmente, váriosestudos sugerem que a secreção de α-Syn poderá estar associada a VEs como ummecanismo de proteção após o comprometimento prévio da autofagia. De facto, adisfunção na autofagia é uma das principais características associadas à DP.Deste modo, o principal objetivo deste trabalho foi investigar a disseminação célula acélula de α-Syn no contexto da DP, averiguando se esta poderá ser mediada por VEs, eparalelamente, a avaliação de funções celulares tipicamente comprometidas nocontexto da doença, como a autofagia e a morte celular.Para isso, usou-se como modelo de DP as células-estaminais neuroepiteliais humanas(hNESCs) derivadas de doentes de DP portadores da mutação LRRK2-G2019S e arespetiva linha isogénica corrigida para a mutação como controlo.Ao longo deste projeto, começamos por estabelecer um sistema de co-cultura indiretapara estudar o transporte de α-Syn entre hNESCs e uma linha celular N2A infetada comum vetor lentiviral (N2A / pLV) sobre-expressando α-Syn. De seguida, para esclarecerse a transmissão de α-Syn poderia ocorrer via VEs, realizaram-se ensaios para elucidarse os VEs derivados de hNESCs poderiam estar associados ao transporte destaproteína quando incubados com células N2A. Por fim, de forma a avaliar uma possívelcorrelação com alguns mecanismos disfuncionais associados à disseminação de PD eα-Syn, quantificaram-se os níveis de alguns marcadores de autofagia, como p62 eLC3B-II, bem como a proteína Caspase-3 associada à apoptose.Em suma, este trabalho fornece algumas noções sobre os potenciais mecanismos dedisseminação de α-Syn entre diferentes células. Embora não possamos descartarformas alternativas de secreção e transporte de α-Syn entre células, os nossosresultados sugerem que as VEs derivadas de células PD foram capazes de disseminarα-Syn em células N2A após 72 h de incubação.Assim, parece haver uma tendência para uma maior propensão para a captação de α-Syn por parte das células portadoras da mutação LRRK2 (hNESCs / MUT),corroborando a hipótese de que a α-Syn possuiu um papel na propagação da patologiano contexto da DP.Parkinson’s Disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder,affecting approximately 4 million people worldwide. It is characterized by the progressivedegeneration and consequent underactivity of the dopaminergic nigrostriatal system,which is responsible for motor coordination. Due to these pathophysiologicalcharacteristics, PD clinical motor symptoms range from muscular rigidity to akinesia,resting tremor, postural instability and lately, in several nonmotor symptoms.Intracellular inclusions of aggregated α-synuclein (α-Syn) in the form of Lewy Bodies(LBs) are the main hallmark of this disease. The process by which α-Syn elicits itsneurotoxic effects is still not fully established. There is evidence that oligomeric speciesof α-Syn can possibly be key toxicity inducers and also play a role in the spreading ofthe pathology throughout the CNS. However, there are still many questions to answer:How can α-Syn spread throughout the brain? How does uptaken α-Syn inducepathology in healthy recipient cells?Emerging evidence suggests that extracellular vesicles (EVs) play a role in the cell-to-cell propagation of α-syn throughout the CNS. Furthermore, several studies report EVs-associated α-Syn secretion as a protective mechanism after upstream blockage ofautophagy. In fact, autophagy impairment is one of the main dysfunctional pathwaysassociated to the pathology of PD.Taking all this into account, the main goal of this work was to study the cell-to-celltransmission of α-Syn in the context of PD, disclosing whether this transport may bemediated by EVs, along with the evaluation of typically impaired cellular functions of thedisease, such as autophagy and cell death.To achieve our aims, we used as a PD model, the human neuroepithelial stemcells (hNESCs) derived from PD patients carrying theLRRK2-G2019S mutation and the respective isogenic corrected line as a control.In the course of this work, we started by establishing an indirect co-culture system tostudy α-Syn transport between hNESCs and an infected N2A cell line with a lentiviralvector (N2A/pLV) overexpressing α-Syn. In order to understand whether α-Syntransmission could occur via EVs, we also performed assays to find out whetherhNESCs-derived EVs could be associated to the transport of this protein whenincubated with N2A cells. To evaluate a possible correlation with some dysfunctionalmechanisms associated with PD and α-Syn spreading, we also quantified the levels ofsome autophagy related-proteins, such as p62 and LC3B-II as well as the apoptosis-associated protein Caspase-3.In general, this work provides some insights on the possible mechanisms bywhich α-Syn can spread between different cells. Although we cannot exclude other waysof α-Syn release and transport from and between cells, we here demonstrated that EVsderived from PD cells were capable of setting down α-Syn in N2A cells after 72h ofincubation. Thus, it appeared to be a tendency to an increased propensity for the uptakeof α-Syn by cells carrying the LRRK2 mutation (hNESCs/MUT), corroborating thehypothesis of pathology spreading associated to α-Syn in the context of PD