Caracterização abrangente do proteoma cerebral de um modelo animal 6-OHDA: novas ideias sobre a doença de Parkinson

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaParkinson's disease (PD) is a common neurodegenerative disorder associated with motor and cognitive impairments. It is characterized by dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatal budle, which has repercussions to other brain regions producing the motor (parkinsonism) and non-motor symptomatology characteristic of PD. Research efforts have been directed toward understanding the etiology and pathogenesis of PD in the hope of developing a more effective therapy that will slow or halt the natural progression of PD. In this sense, study of structural, as well as, functional modifications in the different brain areas is fundamental. A similar dopaminergic neuronal loss in the substantia nigra (SN) and motor symptoms can be achieved on intracerebral administration of the neurotoxin 6-hydroxydopamine (6-OHDA). In order to gain a better understanding of the molecular changes relevant to PD, it was performed a comparatively analysis of the proteome changes in four brain regions (cortex, cerebellum, hippocampus and striatum) using a 6-OHDA-induced PD rat model with the objective of: i) identifying region specific protein abundance changes; ii) identifying which major pathways are altered by those proteins and at the same time are characteristic of the pathology; and iii) evaluating the viability of 6-OHDA model to “mimic” PD characteristics and identification of new potential mechanisms associated with the disease. To achieve these goals, SWATH-MS analysis was performed for quantitative comparison of the four tissues referred above between control animals (Sham group) and PD animals (6-OHDA group). It was possible to quantify 1998, 2573, 2277, 1790 proteins for cortex, cerebellum, hippocampus and striatum, respectively. From those proteins, a total of 202, 341, 477 and 183 proteins in cortex, cerebellum, hippocampus and striatum, respectively, passed the quality filters and statistical tests (50% alteration). Bioinformatics tools allowed an overall characterization of the identified proteins for pathway enrichment and expression profiles. From the altered pathways observed in clustering analysis, eight main pathways were analysed due its involvement in PD pathologic mechanisms: Parkinson’s disease, oxidative phosphorylation, calcium signalling, synaptic vesicle cycle, dopaminergic synapses, gluthathione metabolism, protein processing in endoplasmatic reticulum and PI3k/Akt signalling. Altogether, these findings highlight several pathways affected in PD that present molecular changes in this model, confirming the validity of this model to study molecular alterations associated with PD. In the future, more studies need to be performed in order to confirm the alteration at the protein expression level identified in this work, and to clarify the potential function or dysfunction induced by the alterations observed in this screening.A doença de Parkinson (PD) é uma desordem neurodegenerativa comum associada a impedimentos cognitivos e motores. É caracterizada pela neurodegeneração dopaminérgica da via nigrostriatal, tendo repercussões em outras zonas do cérebro, produzindo assim a sintomatologia motora (parkinsonismo) e não motora, que caracterizam a PD. A sua investigação tem feito esforços para tentar entender a etiologia e patogénese da PD na esperança de desenvolver uma terapia mais eficiente que possa abrandar ou parar a progressão natural da PD. Neste sentido, o estudo das mudanças estruturais, assim como funcionais nas diferentes áreas do cérebro é fundamental. Através da administração intracerebral da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é possível atingir uma perda dopaminérgica neuronal na substantia nigra (SN) e sintomas motores similares. Para atingir um melhor entendimento das mudanças moleculares relevantes à PD, foi executada uma análise comparativa das alterações no proteoma em quatro zonas do cérebro (córtex, cerebelo, hipocampo e estriado) utilizando um modelo de Parkinson induzido pelo 6-OHDA em ratos com o objectivo de: i) identificar mudanças de abundancia de proteínas em regiões específicas; ii) identificar que vias principais são alteradas por essas proteínas e ao mesmo tempo são características da patologia; e iii) avaliar a capacidade do modelo 6-OHDA de simular a PD, para poder entender a sua viabilidade de ser utilizado como um modelo PD e para identificação de novos potenciais mecanismos associados com a doença. Para atingir estes objetivos, foi utilizada uma análise SWATH-MS para comparação quantitativa dos quatro tecidos referidos acima entre animais controlo (grupo SHAM) e animais PD (grupo 6-OHDA). Foi possível quantificar 1998, 2573, 2277 e 1790 proteínas para o córtex, cerebelo, hipocampo e estriado, respetivamente. Dessas proteínas, um total de 202, 341, 477 e 183 no córtex, cerebelo, hipocampo e estriado respetivamente, passaram os filtros de qualidade e testes estatísticos (alteração de 50%) e foram consideradas como sendo alteradas entre os dois grupos. As ferramentas bioinformáticas utilizadas permitiram-nos uma caracterização geral das proteínas identificadas para análise das vias e perfis de expressão. Das vias alteradas observadas na análise cluster, foram analisadas oito vias principais devido ao seu envolvimento com os mecanismos patológicos da PD: doença de Parkinson, fosforilação oxidativa, sinalização de cálcio, ciclo das vesiculas sinápticas, sinapses dopaminérgicas, metabolismo glutatione, processamento de proteínas no reticulo endoplasmático e sinalização Pl3k/Akt. Em conjunto, estas descobertas evidenciam várias vias afectadas na PD que estão presentes neste modelo, confirmando a validade deste modelo para estudar alterações moleculares associadas com a PD. No futuro, terão de ser executados mais estudos para que se possa confirmar a alteração a nível de proteínas identificada neste trabalho, assim com para clarificar a potencial função ou disfunção induzida pelas alterações observadas neste estudo.Outro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF) through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., OE FCT/MCTES (PIDDAC) under projects: POCI-01-0145-FEDER-029311, POCI-01-0145-FEDER-007440 (strategic project UID/NEU/04539/2019), POCI-01-0145-FEDER-016428 (ref.: SAICTPAC/0010/2015), and POCI-01-0145-FEDER-016795 (ref.: PTDC/NEU-SCC/7051/2014); POCI-01-0145-FEDER-029311 (ref.: PTDC/BTM-TEC/29311/2017); POCI-01-0145-FEDER-30943 (ref.: PTDC/MEC-PSQ/30943/2017); PTDC/MED-NEU/27946/2017; and by The National Mass Spectrometry Network (RNEM) under the contract POCI-01-0145-FEDER-402-022125 (ref.: ROTEIRO/0028/2013