Cell culture initiation from isolated tamarillo (Solanum betaceum Cav.) protoplasts

Dissertação de Mestrado em Biodiversidade e Biotecnologia Vegetal apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaSolanum betaceum (Cav.), vulgarmente conhecido como tamarilho ou tomate de árvore, é uma Solanaceae que produz frutos comestíveis com interesse económico. A baixa variabilidade genética observada em populações naturais desta espécie, devido à endogamia natural, impõe limitações aos programas de melhoramento, que podem ser superadas pela combinação de abordagens clássicas e biotecnológicas.Os protoplastos têm um grande potencial no melhoramento de plantas, uma vez que podem ser usados para transformação genética, hibridização somática e regeneração a partir de uma única célula. Poucos dados estão disponíveis sobre o isolamento, cultura e regeneração de protoplastos de tamarilho. Trabalhos anteriores realizados no nosso laboratório permitiram o isolamento de protoplastos, mas sem que ocorressem divisões. Apresentam-se agora os primeiros resultados mostrando a divisão celular em protoplastos de tamarilho em cultura a partir de folhas de rebentos in vitro e linhas celulares embriogénicas.O isolamento de protoplastos foi conseguido utilizando uma combinação de 2 % (p/v) de celulase "Onozuka" R-10 e 0,5 % (p/v) de macerozima R-10 em solução de isolamento (0,4 M manitol, 20 mM MES-KOH, 20 KCl mM, BSA a 0,1 % e CaCl2 10 mM), durante a noite a 27 ºC, no escuro, com agitação. Após a digestão da parede celular, os protoplastos foram purificados sob centrifugação a 100 g durante 5 min. Os protoplastos depositados numa banda de interfase foram removidos para meio fresco da mesma composição da solução de isolamento, mas sem as enzimas. Os rendimentos médios, avaliados por contagem direta em hemocitómetro, deram um rendimento de 7,75±6,74 x 105 protoplastos g-1 PF. Os ensaios de viabilidade, utilizando calcofluor white, bem como a coloração com Evans blue, mostraram que as células viáveis alcançaram valores de 56,78±19,97 %.Os protoplastos isolados foram cultivados em várias condições para testar variáveis tais como meios basais, aditivos dos meios de cultura, reguladores de crescimento de plantas e incorporação de agarose versus cultura em meio líquido. O meio B5 basal, suplementado com 0,1 mg/l de 2,4-D, 1,0 mg/l de NAA e 1,0 mg/l de BAP apresentou os melhores resultados, observando-se a formação da parede celular e divisões celulares após sete dias de cultura. Ao fim de 15 dias de cultura era já visível a formação de microcolónias.Solanum betaceum (Cav.), commonly known as tamarillo or tree tomato, is a Solanaceae that produces edible fruits with economic interest. The low genetic variability observed in natural populations of this species, due to natural inbreeding, imposes limitations to breeding programs, that can be overcome through the combination of classical and biotechnological approaches.Protoplasts have a large potential for plant breeding since they can be used for genetic transformation, somatic hybridization and single cell regeneration. Few data are available over the isolation, culture and regeneration from protoplasts of tamarillo. Previous work carried out in our lab allowed the isolation of protoplasts but without further division. Now results showing cell division in cultured protoplasts of tamarillo from in vitro established shoots and embryogenic cell lines are presented for the first time.Protoplast isolation was achieved using a combination of 2 % (w/v) cellulase “Onozuka” R-10 and 0.5 % (w/v) macerozyme R-10 on isolation solution buffer (0,4 M manitol, 20 mM MES–KOH, 20 mM KCl, 0.1% BSA e 10 mM CaCl2), overnight at 27 ºC, in the dark with agitation. Following digestion of the cell wall protoplasts were purified under centrifugation at 100 g for 5 min. Protoplasts settled in an interphase band being removed to fresh medium of the same composition of the isolation solution but without the enzymes. Average yields, evaluated by direct counting in a hemocytometer, gave a number of 7.75±6.74 x 105 protoplasts g-1 FW. Viability assays, using calcofluor white as well as blue Evans staining, showed that viable cells reached values of 56.78±19.97 %.Isolated protoplasts were cultured in several conditions to test variables such as basal media, culture media additives, plant growth regulators and agarose embedding versus liquid culture. B5 basal medium, supplemented with 0.1 mg/l 2,4-D, 1.0 mg/l NAA and 1.0 mg/l BAP, showed the best results, with cell wall formation and cell divisions being observed after 7 days of culture. After 15 days of culture the formation of microcolonies was already visible.Outro - Project “RENATURE - Valorization of the Natural Endogenous Resources of the Centro Region” (CENTRO-01-0145-FEDER-000007), funded by the Comissão de Coordenação da Região Centro (CCDR-C) and subsidized by the European Regional Development Fund (FEDER). Project PTDC/BAA-AGR/32265/2017 "Tamarillo breeding: better plants for better products"