The effect of exercise and tumor necrosis factor inhibitor on peripheral and axial inflammation in an animal model of spondyloarthritis

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A espondilite anquilosante é a mais comum entre as doenças espondiloartriticas e tem uma prevalência entre 1,0-1,4% na população mundial, e 1,6% entre a população de Portugal. A patogénese da EA inclui sinovite, entesite com mecanismos controversos do desenvolvimento da doença que são caracterizados por uma formação óssea local excessiva, também associada à perda sistémica óssea. A inflamação articular resulta em inchaço que causa dor, perda de mobilidade, rigidez articular e danos ósseos. Atualmente, são desenvolvidas estratégias terapêuticas mais eficazes, principalmente para evitar danos ósseos permanentes, causados por esta doença, para que um número maior de pacientes possa entrar em remissão. O fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina que é responsável pela mediação de processos inflamatórios e atividades de imunorregulação, acabando por possuir um papel muito central neste tipo de patologias. Na patologia de EA, o TNF para além de ser um mediador inflamatório sistémico é também responsável pela modulação da renovação óssea. Estudos passados revelaram que níveis séricos dessa citocina foram encontrados mais elevados em pacientes diagnosticados com EA. Os tecidos sinoviais e estesiais dos pacientes com EA também têm sido identificados com elevados valores de TNF. Desta forma o TNF vai desempenhando na EA um papel pró-osteoclastogénico e anti-osteoblastogénico, propondo a existência de uma resposta local através da regulação positiva dos osteoclastos (OCs) e osteoblastos (OBs) (células responsáveis pela reabsorção, formação e mineralização óssea). A presença de células do sistema imunológico e a expressão de citocinas pró-inflamatórias na entese de pacientes com EA já foram relatadas em estudos passados, no entanto, os mecanismos que levam a este acontecimento são pouco compreendidos. Potencializando, a necessidade de desenvolver novos estudos para compreender mais aprofundadamente a EA. Existem também vários estudos que consideram o stress mecânico como um fator estimulante no desencadear deste tipo de doenças. Alguns estudos em ratinhos sugeriram que o stress mecânico poderia estar associado a esta patologia. Estes estudos observaram que comportamentos agressivos e condições de alojamento demonstraram afetar a expressão da doença. Assim como através da imobilização mecânica das patas anteriores e suspensão da cauda, demonstrou menor progressão da doença. No entanto existe falta de provas concretas em que o stress mecânico afeta diretamente o desenvolvimento desta doença. A terapia de inibição do TNF (TNFi) tem sido extensivamente investigada e as terapias têm demonstrado ser frequentemente utilizadas no tratamento de algumas doenças reumatológicas, não atuando apenas na redução da inflamação, mas também na interrupção da destruição articular. Dados de ensaios clínicos, onde pacientes com EA ativa reportam não apenas redução da dor inflamatória nas costas, mas adicionalmente melhoria da mobilidade física, fadiga e qualidade de vida. Foi também demonstrado que a terapia com TNFi é capaz de bloquear parcialmente os mecanismos envolvidos nos danos ósseos. No entanto ainda não foi comprovado que este tratamento consegue interromper a nova formação de osso em EA. Existe ainda a necessidade de estudos adicionais para poder responder ou elucidar os diferentes pontos acima mencionados. Consequentemente ratinhos são frequentemente utilizados como modelos de estudos para a biologia humana, devido a existência de semelhanças genéticas e fisiológicas entre as espécies. Por este motivo a EA é estudada principalmente em modelos animais, uma vez que existe dificuldades na obtenção de amostras sinoviais e de enteses de pacientes. Assim como as amostras periféricas das articulações da coluna vertebral são particularmente as mais difíceis de obter. Neste estudo foi então utilizado um modelo animal que representa a patologia de espondiloartrite (SpA) através da expressão da forma transmembranar de TNF tmTNF(TgA86). Este estudo tem como primeiro objetivo abordar a caracterização deste modelo animal no desenvolvimento desta patologia, segundo avaliar o impacto do stress mecânico neste modelo animal e terceiro analisar o efeito causado pela administração da terapia de TNFi. No decorrer deste estudo foram realizadas avaliações clínicas, seguidas de análise de imagens histológicas marcadas com Safranina e Hematoxilina/Eosina através de uma aplicação de scores semiquantitativos. Ao caracterizar o desenvolvimento desta doença no modelo animal a avaliação inicial clínica mostrou que os ratinhos TgA86 desenvolveram a doença espontaneamente entre as 3 e 4 semanas de idade, com 100% de penetrância e sem perda de peso, conforme descrito na literatura. Este modelo de ratinho mostrou também exibir as características de SpA de poliartrite inflamatória, edema articular e deformações nas patas posteriores e anteriores. A cauda quando foi medida e comparada com a dos ratinhos saudáveis, mostrou-se mais curta e com deformidades, apresentando características da doença. A análise histológica confirmou estes resultados clínicos, através da análise estatística que apresentou desenvolvimento da doença nas patas anteriores, coluna e cauda, onde, entre as articulações axiais, a cauda desenvolveu a patologia primeiro e com mais severidade quando comparada com a coluna. Estes resultados foram provavelmente devido à fisiologia do animal onde a distribuição do seu peso ocorre sobretudo sobre as patas traseiras, onde a cauda desenvolve mecanismos biomecânicos de equilíbrio corporal. Globalmente os resultados mostraram que a severidade da doença aumentou gradualmente com o tempo, através do agravamento da inflamação, erosão óssea e da degradação da cartilagem. Particularmente os discos intervertebrais são severamente danificados na cauda, entesites e proeminente infiltrado inflamatório são também observados. Relativamente ao stress mecânico os ratinhos foram submetidos a um protocolo de exercicio físico utilizando a metodologia acima descrito. Os nossos resultados mostraram que, em geral, o stress mecânico, afeta o desenvolvimento da doença nos ratinhos que expressam a doença. Nestes, a doença expressa-se numa forma mais severa em comparação com os ratinhos saudáveis, bem como os ratinhos que expressam a doença e que não foram submetidos ao exercício. Estes dados estão em linha com os nossos resultados da avaliação clínica realizados durante o protocolo de treadmill. Especialmente nas articulações periféricas, onde os ratinhos exercitados e que expressam a doença, apresentam um aumento da inflamação e danos na cartilagem. Estes resultados surgem através da observação da presença de eritema, inchaço, deformações e perda de funcionamento articular. Em resumo, estes dados fornecem um vínculo entre a biomecânica e a inflamação onde esta é promovida em locais específicos do sistema músculo-esquelético na existência de EA. Consequentemente, o stresse mecânico é sentido pelas células pró-inflamatórias nas regiões articulares, o que indica que nesses locais, as forças biomecânicas são então traduzidas para sinais bioquímicos, como quimiocinas, sendo estas responsáveis pela desencadear de sinais inflamatórios locais podendo conduzir a destruição óssea. No que diz respeito à análise do efeito da terapia inibidora de TNF um equivalente para ratinho de certolizumab pegol (CZP) foi administrado. O modelo de ratinho TgA86 foi submetido a um tratamento precoce às 4 semanas de idade e um tratamento tardio às 10 semanas de idade. As análises histológicas das articulações periféricas (patas traseiras) mostraram uma diminuição significativa da atividade da doença quando ambos os tratamentos foram administrados. No entanto, os resultados demonstram através de comparações entre os dois períodos de tratamento realizados, que o mais precoce mostrou ser mais eficiente no controlo e prevenção do desenvolvimento da doença. Isto pode ser explicado pelo fato de os ratinhos TgA86 com 10 semanas de idade já apresentarem a doença estabelecida. O que se torna problemático na restauração da estrutura óssea, pois os danos existentes podem ser já irreversíveis, devido ao comportamento agressivo da doença. A administração da terapia mostrou a nível axial (cauda e coluna) e periférico (pata) conseguir controlar efetivamente a inflamação sinovial, bem como prevenir os ossos e articulações da degradação, neste modelo animal. Embora o mecanismo de ação completo do TNFi não esteja completamente compreendido, este trabalho trouxe informações sobre os eventos locais que ocorrem nas articulações periféricas e axiais após a administração do tratamento. Em sumário os nossos resultados demonstram que o modelo animal TgA86 apresenta manifestações semelhantes a EA e apresenta desenvolvimento e progressão da doença ao longo do tempo, sugerindo que este modelo animal em geral tende a ser um bom modelo para estudos futuros. Adicionalmente concluímos que o stresse mecânico pode ser considerado um fator contribuinte para o agravamento desta doença neste modelo animal. Relativamente à terapia de inibição do TNF foi observado que a sua eficácia é dependente do estado de desenvolvimento da doença no momento da administração. Os nossos resultados demonstram que a eficácia terapêutica do inibidor de TNF é superior quando administrado numa fase inicial da doença.Ankylosing spondylitis is the most common among spondyloarthritic diseases and has a prevalence between 1.0-1.4% in the world population, and 1.6% within Portugal population. The pathogenesis of AS includes synovitis, enthesitis with controversial mechanisms of disease development that are characterized by excessive local bone formation, and at the same time it is also associated with systemic bone loss. The joint inflammation results in swelling which causes pain, loss of mobility, joint stiffness and damage. Currently, more effective therapeutic strategies are being developed, mainly to avoid permanent bone damage caused by this disease, so that a greater number of patients can enter into remission. The tumor necrosis factor (TNF) is a cytokine responsible for the mediation of inflammatory processes and immunoregulatory activities, being proposed to play a very central role in this type of pathology. In AS pathology, TNF, besides being a systemic inflammatory mediator, is also responsible for the modulation of bone remodelling. Past studies have shown that serum levels of this cytokine were found to be higher in patients diagnosed with AS. Synovial and enthesial tissues of AS patients also have been identified with high levels of TNF. Therefore TNF plays a pro-osteoclastogenic and anti-osteoblastogenic role in AS, proposing the existence of a local response through the positive regulation of osteoclasts (OCs) and osteoblasts (OBs) (cells responsible for bone resorption, formation and mineralization). The presence of immune system cells and expression of pro-inflammatory cytokines at the enthesis of AS patients was previously shown, however the mechanisms leading to it are poorly understood. Contributing for the development of new studies to improve the AS pathology acknowledgement. There are also several studies that consider stress as trigger in this type of disease. Some studies in mice have suggested that mechanical stress could be associated with this pathology. These studies observed that aggressive behaviours and housing conditions affected the expression of the disease. Others through mechanical strain of the hind paws and suspension of the tail showed less disease progression. However, there is a lack of concrete evidence that mechanical stress can directly affect the development of this disease. The therapy of TNF inhibition (TNFi) has been extensively investigated and shown to be frequently used in the treatment of some rheumatologic diseases, acting not only in reducing inflammation but also in stopping joint destruction. Data from clinical trials, where patients with active AS reported not only reduction of inflammatory back pain, but also improvement of mobility, fatigue and quality of life. It has also been shown that TNFi therapy is able to partially block the mechanisms involved in bone damage. However, it has not yet been proven that this treatment can interrupt new bone formation in AS. Translating to the necessity of further studies taking place to be able to answer or elucidate the subjects mentioned above. Consequently mice are often used as study models for human biology because of the existence of genetic and physiological similarities between species. For this reason, AS is mainly studied in animal models, since there are difficulties in obtaining patients’ synovial and enthesis samples of peripheral and particularly of the spine joints. In this study an animal model was selected and used, that represents the pathology of spondyloarthritis (SpA) through the expression of the transmembrane form of TNF tmTNF(TgA86). The objective of this study is first to approach the characterization of this disease development in this animal model, second to evaluate the impact of mechanical stress on this animal model and third to analyse the effect caused by the administration of TNFi therapy. During this research work, clinical evaluations were performed, followed by analysis of histological images stained with Safranin, Haematoxylin and Eosin (H&E) through the application of semi-quantitative scores. When characterizing the development of this disease in this animal model, the initial clinical evaluation showed that the TgA86 mice spontaneously developed the disease between 3 and 4 weeks of age, with 100% penetrance and without weight loss, as described in the literature. This mouse model also showed the SpA characteristics of inflammatory polyarthritis, joint erythema and deformation on the paws. When measured and compared with healthy mice, the tail was deformed and shorter, presenting characteristics of the disease. Histological analysis corroborated the clinical results, through statistical analysis that showed development of the disease in the hind paws, spine and tail. Where, between the axial joints, the tail developed earlier and more severally the pathology when compared with the spine. These results were probably due to the own physiology of the animal where the distribution of its weight occurs mainly on the hind paws, and the tail develops biomechanical mechanisms of body balance. Nevertheless, the overall results showed that the severity of the disease increased gradually over time, by increasing inflammation, bone erosion and cartilage damage. Particularly the intervertebral discs are severely damaged in the tail, enthesis and prominent inflammatory infiltrate are also observed. Regarding mechanical stress, the mice were submitted to a treadmill protocol and to the same type of methodology above described. Our results showed that, in general, mechanical stress affects the development of the disease in mice exercised expressing the disease. Where the disease is developed in a more severe form compared to healthy mice, and to mice unexercised that express the disease. Histological analysis in the specific locations of the peripheral joints where mice exercised expressing the disease, showed increased inflammation and cartilage damage. This was observed clinically through the presence of erythema, swelling, deformations and loss of function. In summary, these data provided a link between biomechanics and inflammation where it is promoted in specific sites of the musculoskeletal system in AS pathology. Consequently, mechanical stress is sensed by pro-inflammatory cells in regions of the joints, which indicates that at these sites, biomechanical forces are then translated into biochemical signals, such as chemokines, which promote local inflammation and bone destruction. Regarding to the analysis of the effect of TNF inhibitory therapy, an equivalent for mice of certolizumab pegol (CZP) was administered. The mice model TgA86, was submitted to an early treatment at 4 weeks old and a late treatment at 10 weeks old. Histological analyses of the peripheral joints (hind paws) showed a significant decrease of disease activity when both treatments were administered. However, results also showed through comparisons made between the two treatment phases of the, that the earliest phase had a higher success rate in controlling and preventing the development of disease. This can be explained by the fact that disease is already established in the TgA86 mice at 10 weeks of age. This can be considered problematic when comes to remodelling the bone structure, because the existing damage could be already irreversible, due to the disease aggressive behaviour. The administration of the therapy displayed at both peripheral (paw) and axial level (tail and spine) the ability to effectively control the synovial inflammation, as well as to protect the bone damage in the joints in this animal model. Although the full mechanism of CZP action is not fully understood, this work has brought information on local events occurring in peripheral and axial joints after treatment administration. In summary our results show that TgA86 show AS-like manifestations and progression over time, suggesting that this animal model in general could be a good model for future studies. Additionally, we concluded that mechanical stress can be considered a contributing factor for worsening of this disease in this animal model. On the subject of TNF inhibition therapy, it was observed that its efficacy is dependent on the phase of administration in the disease development. Here our results demonstrate superior efficacy when the drug is administered at an earlier stage