HOXB7 and HOXB8 function in breast cancer

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019No século XXI, o cancro é a segunda principal causa de morte no mundo e engloba distintas doenças que têm em comum processos anormais de crescimento celular, com potencial de invadir e metastizar para outros órgãos do corpo humano. O cancro da mama, é o cancro mais incidente nas mulheres e o segundo cancro mais comum globalmente, logo a seguir ao cancro do pulmão. Esta doença afetou cerca de 2,09 milhões de mulheres em 2018 causando a morte de 627 000. Esta doença é altamente heterogênea podendo iniciar-se em tecidos mamários distintos, dando origem, por exemplo, ao cancro da mama ductal, lobular, misto ou cancro da mama inflamatório, entre muitos outros. Além disso, considera-se que o cancro da mama não é uma doença única, mas sim um conjunto de subtipos associados a diferentes estados clínicos que são geneticamente e epigeneticamente distintos. Um estudo realizado em 2000, permitiu distinguir 5 subtipos de cancro da mama com características moleculares diferentes, baseado na expressão positiva ou negativa dos genes que codificam os recetores de progesterona e estrogênio (PR, ER) e o gene que codifica o recetor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Esta classificação tem-se revelado extremamente importante para definir o tratamento e prever a evolução da doença. Tendo em conta esta caracterização molecular, o cancro de mama pode ser dividido em luminal A, luminal B, HER2 positivo (Her2+), normal-like e triplo negativo (TNC). Para além destes biomarcadores, existem outros genes que estão desregulados no cancro de mama e a sua caracterização está a abrir caminho para diagnóstico e tratamentos mais personalizados. Uma das muitas famílias de genes que aparece frequentemente desregulada no cancro da mama são os genes HOX, altamente conservados nos Metazoa. Nos humanos existem 39 genes HOX que estão organizados em 4 grupos (HOXA, HOXB, HOXC, HOXD). Estes genes codificam fatores de transcrição fundamentais para o desenvolvimento embrionário, afetando processos como: proliferação celular, apoptose, diferenciação, mobilidade e sinalização. No entanto, alguns deles estão também envolvidos em importantes processos moleculares durante a vida adulta que envolvem, por exemplo, programas de memória e estabelecimento de identidade celular. No tecido mamário em particular, estes genes estão fortemente envolvidos no seu desenvolvimento tanto no período pré-natal como durante todas as alterações pós-nascimento, nomeadamente durante a puberdade, gravidez, amamentação e subsequente involução. Devido a tudo isto, não é surpreendente verificar um envolvimento de proteínas HOX num contexto oncológico, onde processos em que elas estão tipicamente envolvidas estão fortemente alterados. Sabe-se que no cancro da mama, 27 dos 39 genes HOX estão desregulados, como por exemplo os pertencentes ao grupo HOXB. Entretanto, pouco se sabe sobre os papéis específicos destes fatores de transcrição e sobre os processos moleculares em que estão envolvidos na progressão tumoral. Neste projeto decidimos estudar especificamente os genes HOXB7 e HOXB8. Vários estudos demonstram que o gene HOXB7 tem um papel crucial em diferentes tipos de tumores, inclusive no cancro da mama, e a sua sobre-expressão parece atribuir-lhe propriedades reguladoras capazes de manipular uma grande variedade de moléculas alvo na hierarquia oncogénica. Por outro lado, não existem muitos estudos sobre a função do gene HOXB8 no cancro da mama, sendo que no cancro gástrico e do ovário é um oncogene importante. Assim, o grande objetivo deste trabalho foi explorar o impacto da desregulação dos genes HOXB nos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do cancro da mama in vitro tendo em consideração os diferentes subtipos moleculares. Mais precisamente: 1. Explorar o papel do HOXB7 no cancro da mama, fazendo o seu silenciamento no modelo celular com mais altos níveis de expressão para esse gene (BT-474), representativo do subtipo Luminal B. 2. Explorar o papel do HOXB7 na estaminalidade do cancro da mama, caracterizando os níveis de expressão de 4 marcadores estaminais nas linhas celulares representativas de cada subtipo molecular de cancro da mama e relacionar com os níveis de expressão de HOXB7 nesses contextos genéticos distintos. 3. Explorar o papel do HOXB7 na sinalização do EGFR, que tem sido relacionada com a resistência ao tratamento com tamoxifeno, caracterizando os níveis de expressão de EGFR nos distintos subtipos moleculares de cancro da mama e relacionando com os níveis de expressão de HOXB7 nesses contextos genéticos distintos. 4. Explorar o papel do HOXB7 noutras vias moleculares, caracterizando a expressão de vários alvos putativos da proteína codificada em linhas celulares manipuladas com a sobre-expressão do HOXB7. 5. Explorar o papel do HOXB8 no cancro de mama utilizando células em que o seu silenciamento transiente foi induzido e caracterizando a expressão de 4 marcadores estaminais. Para concretizar os objetivos acima, foram utilizadas várias técnicas. Os estudos in vitro foram realizados em diversas linhas celulares, cada uma representativa dos diferentes subtipos moleculares de cancro da mama. MCF10A, linha celular benigna epitelial, as linhas celulares MCF7 e BT474, representativas do luminal A e B, a SKBR3, que corresponde ao subtipo do HER2 positivos e finalmente as linhas celulares MDA-MB-231 e MDA-MB-468 que representam os cancros triplo negativos. Também foram usadas três linhas celulares manipuladas no nosso laboratório, duas delas com a sobre-expressão estável do HOXB7 (MDA-MB-231_NEO, MDA-MB-231_B7, MDA-MB-231_D3). As células resultantes de um ensaio de silenciamento do HOXB8 com siRNA, também foram usadas para fazer as caracterizações moleculares e estudar a expressão de marcadores estaminais e alvos putativos do HOXB7/HOXB8. Para analisar as expressões dos diferentes genes, foi utilizada a técnica de reverse-transcriptase quantitative PCR e Western Blot. Outra técnica realizada foi o silenciamento transiente, aplicado ao gene HOXB7 usando a linha celular BT-474. Os primeiros resultados obtidos com sucesso permitiram traçar o perfil de expressão génica de quatro marcadores estaminais (OCT4, SOX2, NANOG e CD133) nas diferentes linhas celulares utilizadas. Apuramos que existem diferenças substanciais quando se consideram as linhas celulares representativas dos diferentes subtipos moleculares que, em grande medida, encontram um paralelo com os níveis de sobre-expressão de HOXB7. As células BT474, por exemplo, que apresentam maiores níveis de expressão de HOXB7 são aquelas em que há maior expressão de marcadores estaminais. Adicionalmente, as células MDA468 que expressam mais HOXB7 do que as células MDA231, também apresentam uma maior expressão de marcadores estaminais. Estes resultados sugerem uma associação direta ou indiretamente entre a expressão do gene HOXB7 e a estaminalidade em subtipos particulares de cancro de mama. No entanto, quando avaliamos a expressão destes marcadores em células MDA-MB-231 com a expressão aumentada do gene HOXB7, não identificamos qualquer alteração significativa na expressão, o que sugere que a expressão destes marcadores estaminais não esta relacionada com a expressão do HOXB7 neste subtipo molecular. Em relação ao perfil do EGFR, conseguimos de uma forma quantitativa confirmar o que estava descrito na literatura, observando uma elevada expressão nas células MDA468, comparativamente a outras linhas celulares representativas de subtipos moleculares distintas. Os nossos resultados revelam, no entanto, uma expressão de EGFR mais baixa nas células BT474 do que nas células normais o que vai de encontro a estudos anteriores demonstrando uma relação negativa entre a expressão de marcadores estaminas e EGFR associados à resistência ao tamoxifeno. Tendo em conta que estas células foram as que demonstraram ter maior expressão de marcadores estaminais e de HOXB7, fica em aberto a possibilidade do HOXB7 estar associado a estaminalidade e a expressão de EGFR, levando á resistência ao tamoxifeno no subtipo molecular luminal B. De seguida, caracterizamos uma série de moléculas envolvidas em importantes vias desreguladas no cancro da mama que já foram sugeridos como alvos putativos do HOXB7 (TGF-β, CTNNB1, EGFR, C-MYC, ESR1, FGF2) utilizando as linhas celulares manipuladas com sobre-expressão do HOXB7. Com as análises de reverse-transcriptase quantitative PCR conseguimos verificar que houve alterações nos níveis de expressão dos genes CTNNB1 e ESR1. As variações no gene CTNNB1 vão de encontro com outros ensaios realizados no laboratório em que nomeadamente se avaliou os níveis de expressão da proteína codificada por CTNNB1 (β-catenina) e também se verificou a sua diminuição com a sobre-expressão do HOXB7. Estudamos também a expressão destes marcadores estaminais nas células MDA-MB-231 submetidas ao silenciamento transiente do gene HOXB8, sendo detetado um aumento da expressão do NANOG. Este é o primeiro registo de uma alteração envolvida na estaminalidade devida ao HOXB8. Em resumo, os nossos resultados demonstram que a linha com maior expressão de marcadores estaminais é também aquela com maior expressão do HOXB7 (BT-474) o que sugere uma relação entre o HOXB7 e a estaminalidade neste subtipo de cancro da mama. Mais ainda, o aumento de níveis de expressão do gene CTNNB1 nas linhas celulares manipuladas em que há sobre-expressão do gene HOXB7, leva-nos a crer que este gene possa ter um papel relevante nos cancros triplo negativos como já descrito em outros estudos. A combinação deste resultado com outros ensaios a decorrer no laboratório aponta para que a sobre-expressão do HOXB7 possa levar a um comportamento menos agressivo de células do tipo Triplo-Negativo/Basal B. Detetamos também um potencial efeito do HOXB8 na expressão de marcador estaminal NANOG, que não tinha sido antes identificada. Contudo, mais estudos são necessários para compreender melhor os mecanismos moleculares associados a estas observações. Nomeadamente tendo em conta a caracterização dos níveis proteicos, a utilização de material proveniente de tumores primários e metástases de pacientes e a elaboração de ensaios complementares in vitro e in vivo, o que já está a ser levados a cabo na nossa equipa.In women, breast cancer is the most common cancer worldwide and the second leading cause of cancer death. Breast cancer is a very heterogeneous disease, which can be divided in several subtypes according to their positivity or negativity for progesterone and estrogen receptors (PR, ER) and for human epidermal growth factor 2 (HER2). Breast cancer is frequently associated with HOX gene deregulation but most of the mechanisms affected by this deregulation are still unknown. These genes belong to the homeobox genes family and encode transcription factors, which play a fundamental role in embryonic morphogenesis, but they are also important during adulthood, namely for the cell memory program. This project aims to contribute to the better understanding of HOXB7 and HOXB8 function in breast cancer using an in vitro approach with cell lines representing distinct breast cancer molecular sub-types and normal cells (MCF10A, MCF7, BT474, SKBR3, MDA-MB-231 MDA-MB-468). A broader goal of this project is helping to uncover novel targets to improve prognosis, diagnosis and therapy in distinct breast cancer subtypes. We explored the impact of their deregulation by characterizing its effect on stem markers and the putative targets in breast cancer cells in vitro. We characterised the stem markers and the putative targets of HOXB7 and HOXB8 in breast cancer cell lines by real-time quantitative PCR. In addition, we manipulated HOXB7 and HOXB8 expression in these cell lines to better explore their function in breast cancer. According to our stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and CD133) expression results, BT474 is more stem-like than the other cell lines analysed, MDA-MB-468 is more stem-like than MDA-MB-231, while SKBR3 expresses few stem cell markers. We also analysed the expression of putative downstream targets in the HOXB7 overexpressed cell line: CTNNB1, TGF-β, EGFR, FGF2, ESR1 and c-MYC. The results showed the downregulation of CTNNB1 and ESR1 in a context of HOXB7 up-regulation, but no variation of the expression of the other targets and stem markers in this manipulated cell line was detected. In addition to these results, we also went to see the stem marker expression in the MDA-MB-231 cell line with HOXB8 knockdown where we only saw an increase of expression of NANOG. We tried to do knockdown of HOXB7 in BT474 cell lines, which we didn’t manage to do it. The CTNNB1 mRNA expression results in association with the preliminary results of the functional assays performed in our lab permitted to infer that HOXB7 may have a role in triple-negative cancer. Also, according to the stem markers profile, we hypothesise that there might be an association between HOXB7 and the stem markers in Luminal subtypes. This project started to give some insights into several pathways, which are deregulated in breast cancer and their association to HOX genes. However, we need to note that these results are based on mRNA expression and they need to be confirmed by protein levels. We also need to manipulate more cell lines and analyse their expression profiles and their phenotypes through functional assays. Overall, this project aimed to explore novel targets to improve the prognosis, diagnosis and therapy in distinct breast cancer subtypes