Towards Synthetic Life: Establishing a Minimal Segrosome for the Rational Design of Biomimetic Systems

DNA segregation is a fundamental life process, crucial for renewal, reproduction and propagation of all forms of life. Hence, a dedicated segregation machinery, a segrosome, must function reliably also in the context of a minimal cell. Conceptionally, the development of such a minimal cell follows a minimalistic approach, aiming at engineering a synthetic entity only consisting of the essential key elements necessary for a cell to survive. In this thesis, various prokaryotic segregation systems were explored as possible candidates for a minimal segrosome. Such a minimal segrosome could be applied for the rational design of biomimetic systems including, but not limited to, a minimal cell. DNA segregation systems of type I (ParABS) and type II (ParMRC) were compared for ensuring genetic stabilities in vivo using vectors derived from the natural secondary chromosome of Vibrio cholerae. The type II segregation system R1-ParMRC was chosen as the most promising candidate for a minimal segrosome, and it was characterized and reconstituted in vitro. This segregation system was encapsulated into biomimetic micro-compartments and its lifetime prolonged by coupling to ATP-regenerating as well as oxygen-scavenging systems. The segregation process was coupled to in vitro DNA replication using DNA nanoparticles as a mimic of the condensed state of chromosomes. Furthermore, another type II segregation system originating from the pLS20 plasmid from Bacillus subtilis (Alp7ARC) was reconstituted in vitro as a secondary orthogonal segrosome. Finally, a chimeric RNA segregation system was engineered that could be applied for an RNA-based protocell. Overall, this work demonstrates successful bottom-up assemblies of functional molecular machines that could find applications in biomimetic systems and lead to a deeper understanding of living systems.DNA Segregation ist ein fundamentaler Lebensprozess, notwendig für Erneuerung, Reproduktion und Wachstum aller Lebensformen auf diesem Planeten. Aus diesem Grund muss eine spezialisierte Segregationsmachinerie, ein Segrosom, etabliert werden, sowie zuverlässig funktionieren – auch im Kontext einer Minimalzelle. Konzeptionell folgt die Entwicklung einer solchen einem minimalistischen Ansatz, welcher darauf abzielt, eine synthetische Einheit zu konstruieren, welche ausschließlich aus den grundlegenden Schlüsselelementen besteht, die für das Überleben einer Zelle notwendig sind. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene prokaryotische Segregationssysteme als mögliche Kandidaten für ein minimales Segrosom erforscht. Dieses könnte für ein rationales Design von biomimetischen Systemen Anwendung finden, einschließlich einer Minimalzelle. Segregationssysteme des Typs I (ParABS) und des Typs II (ParMRC) wurden bezüglich ihrer resultierenden genetischen Stabilität in vivo verglichen. Dazu wurden Vektoren verwendet, die vom natürlichen sekundären Chromosom Vibrio cholerae‘s abgeleitet wurden. Das Typ II Segregationssystem R1-ParMRC wurde als der vielversprechendste Kandidat für ein minimales Segrosom ausgewählt, charakterisiert und in vitro rekonstituiert. Es wurde in biomimetische Mikrokompartimente eingekapselt, sowie dessen Lebensdauer durch die Kopplung an ATP-regenerierende und sauerstoffabführende Systeme verlängert. Der Segregationsprozess wurde an die in vitro DNA Replikation gekoppelt durch die Verwendung von DNA-Nanopartikeln, welche den kondensierten Zustand von Chromosomen imitieren. Zusätzlich wurde ein weiteres Typ II Segregationssystem vom pLS20 Plasmid von Bacillus subtilis (Alp7ARC) als sekundäres und orthogonales Segrosom in vitro rekonstituiert. Schließlich, wurde ein chimäres RNA Segregationssystem konstruiert, welches im Zusammenhang einer RNA-basierten Protozelle zur Anwendung kommen könnte. Insgesamt demonstriert diese Doktorarbeit erfolgreiche bottom-up Konstruktionen verschiedener funktionaler, molekularer Maschinen, die bei der Entwicklung von biomimetischen Systemen Anwendung finden und zu einem grundlegenderen Verständnis von lebendigen Systemen auf diesem Planeten führen könnten