Caractérisation d’une phase de persistance intracellulaire du pathogène Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogenic bacterium responsible for a serious disease, listeriosis. Although much work has been done to characterize the virulence mechanisms of this bacterium, there is little data on the mechanisms leading to the asymptomatic carriage of L. monocytogenes in mammalian hosts. One of these mechanisms could be a phase of intracellular persistence. During prolonged infections of human epithelial cells in culture, such as hepatocytes and trophoblast cells, L. monocytogenes changes its intracellular lifestyle. After the active phase of cell-to-cell spread, the bacteria stop polymerizing actin and become trapped in single-membrane vacuoles labeled with the endosomal protein LAMP1.The aim of my thesis was to characterize these "Listeria-Containing Vacuoles" (LisCVs). We have shown that LisCVs are acidic, partially degradative compartments, labeled by the lysosomal protease cathepsin D. Their formation coincides with the disappearance of actin polymerization factor ActA from the bacterial surface and the capture of actin-free cytosolic bacteria by cell membranes. In these compartments, bacterial growth is slowed; a subpopulation is resistant to stress and can survive beyond three days of infection. The use of gentamicin during the infection protocol is not responsible for the formation of LisCVs. However, this antibiotic allows selection of vacuolar bacteria, by specifically inhibiting the growth of cytosolic bacteria. The formation of LisCVs is not specific to laboratory strains. However, the efficacy of the phenomenon could diverge according to the sequence types of L. monocytogenes strains. Vacuolar bacteria have the ability to exit the vacuoles and return to a motile and replicative state during the subculture of infected cells. When expression of the actA gene remains inactive, as in ΔactA mutants, vacuolar Listeria forms persist in host cells in a viable but non-culturable (VBNC) state. These VBNC forms can be transmitted during host cell divisions. All these results reveal a new phase of persistence in the intracellular infectious process of L. monocytogenes during prolonged infections of a subset of epithelial cells. This property could contribute to asymptomatic carriage of this pathogen in epithelial tissues, extend the incubation period of listeriosis, and make bacteria tolerant to antibiotic therapy.Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène intracellulaire facultative responsable d’une pathologie grave, la listériose. Si de très nombreux travaux ont permis de caractériser les mécanismes de virulence de cette bactérie, il existe peu de données sur les mécanismes conduisant au portage asymptomatique de L. monocytogenes dans les hôtes mammifères. L’un de ces mécanismes pourrait être une phase de persistance intracellulaire. Lors d’infections prolongées de cellules épithéliales humaines en culture, comme des hépatocytes et des cellules de trophoblastes, L. monocytogenes change de mode de vie intracellulaire. Après la phase active de dissémination de cellule en cellule, les bactéries arrêtent de polymériser l’actine et se retrouvent piégées dans des vacuoles à simple membrane marquées par la protéine endosomale LAMP1. L’objectif de ma thèse était de caractériser ces « Listeria-Containing Vacuoles » (LisCVs). Nous avons montré que les LisCVs sont des compartiments acides, partiellement-dégradatifs, marquées par la protéase lysosomale cathépsine D. Leur formation coïncide avec la disparition du facteur de polymérisation d’actine ActA de la surface bactérienne et la capture des bactéries cytosoliques dépourvues d’actine par des membranes cellulaires. Dans ces compartiments, les bactéries entrent en croissance ralentie ; une sous-population résiste aux stress et peut survivre au-delà de trois jours d’infection. L’utilisation de la gentamicine lors du protocole d’infection n’est pas responsable de la formation des LisCVs. Cependant, cet antibiotique permet la sélection des bactéries vacuolaires, en inhibant spécifiquement la croissance des bactéries cytosoliques. La formation des LisCVs n’est pas spécifique des souches de laboratoire. Toutefois l’efficacité du phénomène pourrait diverger selon les séquençotypes des souches de L. monocytogenes. Les bactéries vacuolaires ont la capacité de sortir des vacuoles et de retourner vers un état motile et réplicatif, après le passage des cellules infectées. Lorsque l’expression du gène actA reste inactive, comme dans les mutants ∆actA, des formes de Listeria vacuolaires persistent dans les cellules hôtes dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Ces formes VBNC peuvent être transmises au cours des divisions des cellules hôtes. L’ensemble de ces résultats révèle une nouvelle phase de persistance dans le processus infectieux intracellulaire de L. monocytogenes lors des infections prolongées de certaines cellules épithéliales. Cette propriété pourrait contribuer au portage asymptomatique de ce pathogène dans les tissus épithéliaux, allonger la période d'incubation de la listériose, et rendre les bactéries tolérantes à l’antibiothérapie