Potentiation of the effects of combined phenolic compounds from olive oil : study of redox transformations : application in neurodegenerative diseases

Les maladies d’Alzheimer et de Parkinson (MA et MP) sont des maladies neurodégénératives entrainant une diminution des fonctions cognitives et locomotrices et toujours dépourvues de traitements curatifs. La consommation d’huile d’olive et des polyphénols qu’elle contient atténuerait la survenue des démences telles qu’observées dans la MA ou la MP. À ce jour, ces composés phénoliques ont été étudiés de manière isolée afin de caractériser leur réactivité vis à vis des radicaux et leurs effets biologiques, mais les concentrations utilisées (5–100 µM) sont supérieures aux concentrations retrouvées dans le plasma (0.5-2,8 ng/ml). Jusqu’à présent, aucune étude n’a observé les effets de ces composés combinés, alors que l’oleuropéine et le tyrosol, des composés phénoliques parmi les plus abondants dans l’huile d’olive et que l’acide p-coumarique, un dérivé d’acide hydroxycinnamique, sont connus pour leurs activités antioxydantes et leur biodisponibilité. Dans un contexte cellulaire, les composés phénoliques agissent à travers leurs capacités de donneurs d’atomes d’hydrogène et/ou d’électrons, et impactent la régulation des défenses antioxydante. En conditions oxydatives, ils peuvent subir des modifications structurelles et mener à de nouveaux composés. L’impact cellulaire de ces derniers est encore peu étudié, car leur devenir dans le contexte d’un métabolisme oxydatif reste obscur. L’étude des métabolites issus de l’oxydation des composés phénoliques est donc d’une réelle importance afin d’approfondir les connaissances sur leurs mécanismes d’actions au niveau biologique. Nous avons émis l’hypothèse que la combinaison de l’oleuropéine, du tyrosol et de l’acide p-coumarique potentialise leurs effets neuroprotecteurs à travers leurs capacités de donneurs d’électrons et en lien avec la production des métabolites associés. Ce propose une approche pluridisciplinaire intégrant des composantes biologiques et des questions relevant de la physico-chimie, en s’appuyant sur des outils électrochimiques. En premier lieu, nous avons démontré que l’association de ces trois composés (Mix 1) permettait de potentialiser leurs effets neuroprotecteurs avec concentrations efficaces à 0.1 et 1µM, contrairement aux concentrations neuroprotectrices lorsque ces composés sont utilisés individuellement (5 à 10 fois plus élevées). Le Mix1 augmente la réactivité des composés phénoliques vis-à-vis d’espèces réactives de l’oxygène et permet une diminution de leur génération intracellulaire. Cette neuroprotection semble en partie médiée par une régulation des facteurs de régulation rédox endogènes. Dans un second temps, nous avons comparé le comportement en conditions oxydatives acellulaires de l’oleuropéine, du tyrosol et de l’acide p-coumarique individuellement et dans le Mix1. L’analyse en LC-MS2 des composés stables issus de l’oxydation du Mix 1 a montré une diminution des taux d’oxydation relatifs de chacun des composés, ainsi que la détection de trois néocomposés spécifiques de l’oxydation du Mix1. De plus, un effet neuroprotecteur significatif du Mix1 oxydé a été observé dès 1 et 5 nM, ce qui soutient l’hypothèse que les produits issus de l’oxydation des composés phénoliques peuvent participer aux effets biologiques des composés natifs. Notre troisième objectif était d’évaluer si les composés issus de l’oxydation des composés phénoliques pouvaient être générés dans un système biologique. L’analyse en LC-HRMS des extraits de cellules neuronales traitées avec le Mix1 en conditions oxydatives a révélé que ces composés étaient toujours présents sous leurs formes natives dans les cellules après plusieurs heures de traitement. Ce projet multidisciplinaire a permis d’observer les effets des composés phénoliques sous plusieurs angles. Il confirme qu’un effet neuroprotecteur de composés issus de l’oxydation est possible et ouvre la voie à de nouvelles approches pour le développement de formulations efficaces pour limiter le stress oxydatif au niveau cérébral.Alzheimer and Parkinson diseases (AD and PD) are neurodegenerative disorders leading to cognitive function decline and curative treatments are still missing. Olive oil and related phenolic compounds consumption could prevent or slow down cognitive decline through neuronal preservation. Indeed, they have direct antioxidant properties as electrons or H-atom donors, which are largely suspected of being responsible for their biological effects, but also of some indirect properties as modulators of endogenous antioxidant defenses. The secoiridoid oleuropein and the monophenols tyrosol and p-coumaric acid have shown abilities to counteract oxidative injuries and associated neuronal death in several cellular and in vivo models. However, the basic mechanisms of action of phenolic compounds remain to be elucidated. In fact, phenolic compounds are highly sensitive to oxidative modifications and could be transformed into new compounds in an oxidative context. Cellular impacts of these products are rarely considered, probably because their intracellular detection is a great challenge and remain an important field to explore. Moreover, oleuropein, tyrosol and p-coumaric were individually evaluated in order to characterize their own reactivity towards ROS and their biological properties. However, the concentration ranges used to observe neuroprotection in cellular models (5 – 100 µM) were far from the possibly recovered phenolic concentration in plasma (0.5 - 2,8 ng /ml of plasma). To observe an effect with concentration range closer to the physiological ones, several antioxidant combinations could be proposed. Nevertheless, despite the biological promises of phenolic compounds from olive oil, studies which combined some of the most abundant phenolic compounds in the neuroprotection field is still missing. We thus hypothesized that the combination of oleuropein, tyrosol and p-coumaric acid in equimolar proportion (Mix 1) could potentiated their ROS scavenging and neuroprotective properties to counteract oxidative stress-induced neuronal death. These effects could be in part due to their oxidized metabolites. First, we demonstrated that the association of these three phenolic compounds potentiated their neuroprotective effects with efficient concentrations at 0.1 and 1µM, contrary to concentration ranges when there are used individually (5 to 10 higher). The Mix1 increase the reactivity of phenolic compounds towards ROS and decreases their intracellular production. These neuroprotective properties seems, at least in part, lead by a regulation of the endogenous redox factors. Then, we compared the behavior of Oleuropein, tyrosol and p-coumaric acid individually and in the Mix1 under acellular oxidative conditions. The oxidized Mix1 LC-ESI-MS2 profiles showed a regeneration of oleuropein through a decrease of the phenolic compounds oxidation rate and highlight the presence of specific oxidized products in Mix 1. This study also showed a significant neuroprotection of oxidized Ole and oxidized Mix1 with very low concentrations (1 and 5 nM), suggesting the putative relevant role of oxidized Ole products to protect or delay neuronal death. Our third objective was to evaluate if these oxidized metabolites could be produced in a biological system. Even under oxidative conditions, we recovered these compounds in cellular extracts under their native forms after few hours of treatments, attesting their accumulation in neuronal cells. Taking together, our results pointed out the relevance to study the phenolic compounds from a chemical and a biological point of view, which should always be as cellular redox reactions are between biological and chemical fields. Lastly, we confirmed the significance to take into account the oxidized metabolites from phenolic compounds to deeper understand their biological properties