ANTIMICROBIAL EFFECT OF ESSENTIAL OILS ON NONTUBERCULOUS MYCOBACTERIA

Ciljevi istraživanja: Ispitati antimikrobni učinak eteričnih ulja (EU) odabranih mediteranskih biljaka (Juniperus communis, Helichrysum italicum, Lavandula hybrida, Salvia officinalis, Laurus nobilis i Thuja occidentalis) i α-pinena na netuberkulozne mikobakterije (NTM) M. avium, M. intracellulare i M. gordonae te istražiti ulogu navedenih supstancija na biofilm NTM. Željeli smo utvrditi postojanje sinergističkih učinaka ispitivanih EU te kombinirane primjene EU i odabranih antimikrobnih lijekova i odrediti mehanizam djelovanja EU borovice na NTM. Metode: Uspostavom nove metode omogućeno je in vitro ispitivanje antimikrobnog učinka EU na NTM oponašajući uvjete vodoopskrbnih sustava. Određena je minimalna efektivna koncentracija (MEK) kao najmanja djelotvorna koncentracija EU u vodi. Metodom mikrodilucije u bujonu i steriliziranoj vodovodnoj vodi ispitana je osjetljivost NTM na odabrana EU i antimikrobne lijekove. Istražen je učinak inhibitornih i sinergističkih subinhibitornih koncentracija EU borovice i smilja na biofilm NTM na neživim površinama i površinama živih stanica. Mehanizam djelovanja EU borovice proučen je utvrđivanjem stupnja oštećenja stanične stijenke i morfoloških promijena primjenom transmisijskog elektronskog mikroskopa (TEM). Rezultati: EU borovice i smilja pokazala su se najučinkovitijima prema NTM, dok je α-pinen testiran samostalno pokazao slabiji učinak nego cjelovito EU. EU borovice iskazalo je u kombinaciji s EU smilja i tuje te antimikrobnim lijekovima niz sinergističkih učinaka prema NTM. Adhezija NTM na polistiren kao i formiranje biofilma, statistički značajno su inhibirani s porastom temperature i porastom koncentracije EU borovice. Sinergističke kombinacije EU borovice i antimikrobnih lijekova izazvale su povećano istjecanje staničnih makromolekula NTM. TEM uočene su promjene u obliku i strukturi NTM nakon djelovanja EU borovice i sinergističko djelovanje u kombinacijama s EU smilja. Zaključak: Pronašli smo niz sinergističkih kombinacija EU i antimikrobnih lijekova koje mogu imati potencijalnu primjenu u novim načinima sprječavanja adherencije i formiranja biofilma NTM ne samo u vodoopskrbnom sustavu, nego i na umjetnim materijalima koji se koriste u medicini te u biološkim sustavima. Sinergizam prilikom kombinirane primijene EU i antimikrobnih lijekova omogućuju primjenu niskih efektivnih koncentracija s održanim antimikrobnim učinkom ispitivanih supstancija s potencijalno smanjenom toksičnošću. EU borovice izaziva promjene u citoplazmi i oštećenje stanične stijenke NTM što je potvrđeno opaženim povećanim istjecanjem staničnih makromolekula i mikromorfološkim promjenama uočenim TEM.Research objectives: To investigate the antimicrobial effect of essential oils (EO) of selected Mediterranean plants (Juniperus communis, Helichrysum italicum, Lavandula hybrida, Salvia officinalis, Laurus nobilis and Thuja occidentalis) and α-pinene on non-tuberculous mycobacteria (NTM), M. avium, M. intracelullare and M. gordonae and investigate the role of these substances on NTM biofilm. We wanted to determine the synergistic effects of the tested EO and combinations of EO and selected antimicrobials. The aim was also to determine the mechanism of action of common juniper EO on NTM. Methods: The establishment of a new method enabled the in vitro testing of the EO's antimicrobial effect on NTM by mimicking the conditions of water supply systems. The Minimum Effective Concentration (MEC) was determined as the lowest effective EO concentration in water. The sensitivity of NTM to selected EO and antimicrobials was examined by microdilution in broth and sterilized tap water. The effect of inhibitory and synergistic subinhibitory concentrations of common juniper EO and immortelle EO on biofilm of NTM on abiotic and biotic surfaces was investigated. The mechanism of action of common juniper EO has been studied by determining the degree of cell wall damage and morphological changes using a transmission electron microscope (TEM). Results: Common juniper and immortelle EO's proved to be most effective against NTM, while α-pinene tested alone showed poorer effect than overall EO. Common juniper EO have shown a number of synergistic effects, according to NTM, in combination with immortelle and white cedar EO and antimicrobials. The adhesion of NTM to polystyrene as well as biofilm formation were significantly inhibited (p < 0.05) with increasing temperature and increasing concentration of common juniper EO. Synergistic combinations of common juniper EO and antimicrobials have caused increased leakage of NTM cell macromolecules. TEM showed changes in the shape and structure of NTM after the activity of common juniper EO and synergistic effects in combination with immortelle EO. Conclusion: We have found a number of synergistic combinations of EO and antimicrobials that may have potential applications in new ways of preventing the adherence and formation of NTM biofilms not only in the water supply system, but also in artificial materials used in medicine and in biological systems. Synergies with the combined use of EO and antimicrobials allow the use of low effective concentrations with the sustained antimicrobial effect of the test substances with reduced toxicity. Common juniper EO cause changes in the cytoplasm and damage to the NTM cell wall, as evidenced by the observed increased leakage of cellular macromolecules and micromorphological changes observed by TEM