Developing new molecular tools to study and visualize the intermediate filament GFAP in living cells

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Intermediate filaments (IFs) are one of the three major filaments of the cytoskeleton. Due to their intrinsic physical properties, IFs provide mechanical support and give cells the elastic properties that allow them to resist deformation and maintain their shape. Different from actin filaments and microtubules, IFs have a cell type-specific expression pattern, and in mature astrocytes, the main IF protein expressed is the glial fibrillary acidic protein (GFAP). Although the exact function of GFAP remains unclear, GFAP is overexpressed in response to a variety of insults to the Central Nervous System (CNS) and the deletion of GFAP renders mice more susceptible to neurotoxicity. Furthermore, heterozygous gain-of-function mutations in the GFAP gene cause Alexander disease (AxD), a progressive and fatal neurodegenerative disorder that most frequently affects newborns and infants. IFs are the least characterized filaments of the three major cytoskeleton elements. Difficulties in studying the behavior of these filaments, and in particular of GFAP, arise from the fact that these proteins do not tolerate well the presence of protein tags in its termini. Therefore, we aimed to create new and more versatile molecular tools to study the behavior of GFAP in living cells, and that can easily be implemented in the study of other IFs. In this work, we developed a mouse GFAP-HaloTag fused system and the first tagged version of human GFAP. Both versions of tagged GFAP were able to incorporate into the IF network and form a normal filamentous network when transiently transfected in mammalian U251 cells. Opposingly, R236H/R239C AxD-causing mutations disrupted the endogenous filament network of GFAP and altered its diffusion properties. Furthermore, our results also show that GFAP dynamics is intimately linked to that of actin microfilaments and microtubules, as cytoskeleton-destabilizing drugs completely change the diffusion properties of GFAP molecules. Taken together, the results in this thesis demonstrate the enormous potential our two novel systems have for the study of GFAP oligomerization, aggregation, and dynamics in living cells.A habilidade de uma célula de resistir a deformação, transportar carga intracelular ou de mudar a sua forma durante o movimento depende do citoesqueleto. O citoesqueleto é uma rede complexa de filamentos proteicos e proteínas motoras associadas que se estende pelo citoplasma de todas as células, incluindo bactérias e arquea. Em células eucarióticas, o citoesqueleto é composto por três tipos de polímeros, distinguíveis entre si pelo tamanho: filamentos de actina ou microfilamentos (7 nm de diâmetro), microtúbulos (24 nm) e filamentos intermédios (10 nm). Contrariamente aos microfilamentos e microtúbulos, cuja composição é muito semelhante entre todos os tipos celulares, a composição dos filamentos intermédios varia consideravelmente entre diferentes tipos de células, tecidos e órgãos, durante o desenvolvimento e em condições patológicas. Os filamentos intermédios são estruturas extremamente estáveis que fornecem suporte e protegem as células de danos mecânicos ao conferir-lhes propriedades elásticas para resistir à deformação e manter a sua forma. Além destas funções de suporte, estes filamentos desempenham ainda um papel na sobrevivência, divisão e migração celular. Devido à multitude de funções nas quais os filamentos intermédios participam, alterações nos níveis de expressão ou mutações em componentes específicos destes filamentos estão associadas ao aparecimento de várias patologias, a sua grande maioria raras. Apesar da sua enorme estabilidade, os filamentos intermédios são estruturas bastante dinâmicas e muitas vezes a participação dos microtúbulos e dos filamentos de actina é fundamental para a manutenção da sua rede. A proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é o filamento intermédio mais característico dos astrócitos, e é universalmente utilizada como o principal marcador para a sua identificação e classificação. Apesar da estrutura tridimensional desta proteína permanecer desconhecida, pensa-se que possua uma estrutura tripartida que é semelhante entre todos os filamentos intermédios. Esta estrutura consiste num domínio central alfa-helicoidal altamente conservado flanqueado por dois domínios N-terminal e C-terminal, sem uma estrutura secundária definida. Assim como os restantes filamentos intermédios, a GFAP tende a formar filamentos com 10 nm de diâmetro. Primeiramente, ocorre a formação de um dímero através da interação entre os domínios centrais de dois monómeros, que se enrolam um sobre o outro para formar uma estrutura superenrolada. De seguida, estes dímeros associam-se de forma antiparalela para formar tetrâmeros apolares. Posteriormente, com a contribuição dos domínios N-terminais, os tetrâmeros associam- se para formar protofilamentos que, por sua vez, se associam lateralmente para formar os filamentos maturos, com vários nanómetros de comprimento. Contrariamente aos restantes filamentos do citoesqueleto, a construção dos filamentos intermédios é totalmente independente de nucleótidos. Para além de fornecer suporte mecânico aos astrócitos, pensa-se que a GFAP tenha também um papel importante na migração e motilidade celular, na mitose e ainda na manutenção da barreira hematoencefálica. A GFAP está também associada a várias patologias do sistema nervoso central, tais como a doença de Alexander. A doença de Alexander é uma doença neurodegenerativa rara, fatal e progressiva que afeta essencialmente recém-nascidos e crianças. Esta doença resulta do aparecimento de mutações pontuais no gene que codifica para a GFAP e é caracterizada pela acumulação massiva deste filamento intermédio, juntamente com proteínas de stress, em estruturas citoplasmáticas complexas, denominadas por fibras de Rosenthal. Atualmente, os filamentos intermédios são os polímeros menos caracterizados do citoesqueleto e o nosso conhecimento atual relativamente à sua estrutura tridimensional, bem como dos processos dinâmicos envolvidos na sua construção, está muito longe de estar completo. Esta escassez de conhecimento relativamente à organização e dinâmica dos filamentos intermédios deve-se em parte à dificuldade em visualizar estes filamentos in vivo. Isto acontece porque estes filamentos, e em particular a GFAP, não toleram bem a presença de marcadores proteicos nos seus terminais, como por exemplo as proteínas fluorescentes, já que estes causam a rutura ou desorganização dos filamentos e levam à sua agregação. Assim, o principal objetivo deste trabalho é desenvolver novos modelos celulares para o estudo da oligomerização, função e dinâmica da GFAP em células vivas. No presente estudo, começámos por construir um plasmídeo no qual a GFAP de ratinho foi ligada a uma HaloTag (mGFAP-HT), de forma a puder estudar a arquitetura e o comportamento da GFAP a um nível nanoscópico. A HaloTag é uma alternativa atrativa às proteínas fluorescentes, uma vez que combina a especificidade genética destas proteínas com as propriedades foto-físicas superiores de ligandos orgânicos, uma característica que a torna muito apelativa para microscopia de super-resolução e outras técnicas avançadas. Neste trabalho desenvolvemos também com sucesso a primeira versão marcada da GFAP de humano inserindo, de forma aleatória, a proteína fluorescente EGFP dentro da região codificante da GFAP. Quando expressos transientemente nas células de glioblastoma humano U251, ambos os sistemas foram capazes de se integrar na rede de filamentos intermédios endógena destas células e de formar estruturas filamentosas típicas da GFAP em aproximadamente 90% das células. Por forma a estudar o efeito que as mutações relacionadas com a doença de Alexander têm na construção dos filamentos da GFAP, gerámos o mutante de ratinho R236H e o mutante de humano R239C, por mutagénese dirigida. Os nossos resultados mostram que na maioria das células transfetadas com os plasmídeos mutantes, a GFAP não é capaz de formar uma rede filamentosa. No entanto, o comportamento da GFAP mutante não é o mesmo nos dois modelos. Enquanto que o mutante de humano R239C formou maioritariamente pequenos agregados, o mutante de ratinho R236H formou um padrão homogéneo disperso pelo citoplasma das células, sem nenhuma estrutura filamentosa aparente. Embora vários esforços continuem a ser feitos para tentar encontrar um composto que seja eficaz contra a doença de Alexander, a verdade é que esta doença permanece intratável e incurável. No entanto, estudos recentes demonstraram que a especiaria curcumina tem um efeito benéfico na redução da agregação da GFAP. Desta forma, decidimos testar o efeito neuroprotetor de dois compostos sintéticos e derivados da curcumina, J147 e CNB-001, na redução da agregação do mutante humano R239C. Observámos que, no nosso modelo celular, o composto CNB-001 é mais eficaz que o J147 e que apenas as células que cresceram na presença de CNB-001(10 μM) mostraram um aumento ligeiro, embora significativo, na formação de filamentos e uma respetiva diminuição da agregação da GFAP. O plasmídeo mGFAP-HT foi ainda utilizado para estudar a dinâmica da GFAP de ratinho. Os nossos resultados mostram que a mutação R236H tem um forte efeito na dinâmica da GFAP, aumentando consideravelmente a sua velocidade de difusão, comparativamente à GFAP não mutada. Os filamentos intermédios estão em constante comunicação com os restantes elementos do citoesqueleto, e muitas vezes a sua dinâmica está dependente destes. Os nossos resultados são consistentes com estas observações, e demonstram que a despolimerização dos microfilamentos de actina ou dos microtúbulos resulta numa diminuição significativa da velocidade de difusão das moléculas de GFAP, e num aumento da percentagem de moléculas com uma difusão mais lenta. Em suma, os resultados apresentados neste trabalho demonstram o enorme potencial dos dois sistemas que construímos no estudo da função, oligomerização e dinâmica da GFAP em células vivas. Em teoria, estas estratégias, podem também ser utilizadas para o estudo de qualquer outro filamento intermédio. O desenvolvimento de novos e mais versáteis modelos celulares, continua, no entanto, a ser indispensáveis para uma melhor compreensão do comportamento da GFAP em células vivas e também dos mecanismos pelos quais mutações nesta proteína causam a doença de Alexander