Identification and Manipulation of Cystatins to Control Mycobacterium tuberculosis Infection of Human Macrophages

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019Tuberculosis (TB) is a disease caused by the facultative intracellular species Mycobacterium tuberculosis (Mtb), one of humankind’s most ancient and successful pathogens. The eradication of Mtb infection has been a problem over the ages, due to pathogen’s ability to survive in host cells and escape the immune defense mechanisms. One efficient mechanism to kill pathogens occurs within macrophages, innate immune cells that use, among others, phagocytosis, a mechanisms by which the macrophage engulfs the bacteria in a structure called the phagosome which matures and in which a series of killing events will the clear pathogens. Specifically, the content of the phagosome will acquire proteolytic enzymes, as is the case of cathepsins, that will take relevant role in pathogen destruction at the low pH environment of the phagolysosome and, not less relevant, processing pathogen antigens to be presented to lymphocytes and therefore to expand the immune response. Recent studies revealed that Mtb is able to regulate cathepsins at the level of the gene expression and activity, increasing its survival inside macrophages. Cathepsins are regulated by their inhibitors, cystatins, which bind their active site and down-regulate cathepsins activity. Since Mtb was shown to down-regulate cathepsin activity we hypothesize that the cystatin pathway might be explored to improve the processes dependent on cathepsin activity such as pathogen destruction and antigen processing by type II HLA complexes, to counter the ability of Mtb to survive during infection. In the first part of the study we target cystatin C, since it is described to be a major inhibitor of cathepsin S, an important cathepsin enrolled in pathogen clearance and antigen presentation. By silencing the mRNA of cystatin C we do hypothesized to prevent it from inhibiting cathepsins activation during several models of mycobacteria infection including the vaccine species Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) and the non-virulent species Mycobacterium smegmatis infection. Overall, our results after cystatin C silencing, indicate an increase in proinflammatory responses by infected macrophages, concomitant with an increase of mycobacteria killing, and an improvement of the expression of HLA-DR receptors on the cell surface. In parallel, we focused on the influence of protease inhibitors (PIs) used in HIV therapy, as an alternative model to cystatin silencing, to control cathepsin activity within macrophages during mycobacterial infections. We assessed the effects of saquinavir and ritonavir on the antigen presentation HLA class II complexes expression at the cell surface and on the mycobacterial killing/survival effects. We found notable interactions between the infected cells and the protease inhibitors, particularly saquinavir was observed to increase the expression of HLA-DR on the cell surface and increased mycobacterial killing, while ritonavir decreased HLA-DR expression on the surface and contributed to an increased mycobacterial survival. Altogether our results show that by manipulating cystatin C expression in macrophages and/or the treatment of infected cells with PIs, leads to macrophage interference of cathepsins and therefore with macrophages defense mechanisms. Thus suggests that cystatins and PIs manipulation are a potential tool to improve the host cellular immunity against Mtb and be used as an host-targeted therapeutic.A tuberculose é uma doença infeciosa que se desenvolve, na maioria dos casos, nos pulmões, causada por um agente patogénico intracelular facultativo do complexo Mycobacterium tuberculosis spp que inclui a espécie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e o Mycobacterium bovis. Apesar do desenvolvimento de antibióticos para terapêutica e do melhoramento da qualidade sanitária ao longo dos anos, nos dias de hoje a tuberculose é considerada uma das 10 maiores causas de morte por doença infeciosa. Isto deve-se à capacidade adaptativa deste agente patogénico, que levou ao aparecimento de formas multirresistentes a antibióticos, tornando difícil a sua irradicação no mundo. A capacidade adaptativa do M. tuberculosis levou à aquisição de mecanismo que contornam os mecanismos de defesa do hospedeiro. O sistema imunitário responde ao contacto pelos microrganismos, iniciando-se o recrutamento de células imunes inatas como, os macrófagos e células dendríticas, os quais são a primeira linha de defesa celular do hospedeiro. Os macrófagos têm a capacidade de destruir conteúdo extracelular através de um processo denominado fagocitose, este processo inicia-se quando os macrófagos reconhecem e internalizam a bactéria a vesícula chamada fagossoma, que passa por diferentes estádios de maturação através de uma série de fissões e fusões parciais do organelo com endossomas tardios. O estádio final de maturação após fusão com os lisossomas primários dá origem ao fagolisossoma. O conteúdo desta vesicula possuí enzimas hidrolíticas que no pH acídico desse lúmen ficam ativadas, proporcionando condições ambientais ótimas para a degradação dos microrganismos internalizados. Contudo, Mtb consegue escapar a este sistema, impedindo a sua maturação e bloqueando no seu nicho ao estado de vesicula fagossomal imatura. Deste modo persiste intracelularmente limitando a sua interação com estes mecanismos degradativos o que lhe permite sobreviver e inclusivamente replicar-se em macrófagos de granulomas nos pulmões. Assim, na maioria dos casos o balanço entre a sobrevivência, a replicação da bactéria e o recrutamento e ação das células do sistema imune leva a que a infeção fique confinada a uma estrutura denominada granuloma que permite o seu controlo. O indivíduo encontra-se infetado mas não demonstra ter sintomas de doença, existindo uma doença/infeção latente que pode ser ativada em qualquer momento que o organismo desenvolva imunodepressão. Um grupo muito importante de enzimas proteolíticas que se encontram no lúmen das vesículas fagocitárias, são as catepsinas. Estas hidrolases lisossomais clivam as ligações peptídicas levando à degradação proteica e atuam no processamento de péptidos para apresentação de antígenos, contribuindo para a morte de agentes patogénicos. Foi observado em estudos que uma das catepsinas com maior nível de expressão durante a infeção, na fagocitose e nos macrófagos, é a catepsina S, cuja principal função é apresentar antigénios ao complexo principal de histocompatibilidade classe II (MHC II em ratinho ou HLA II em humanos). Apesar das catepsinas serem bastante expressas durante a infeção, elas são controladas pelos seus inibidores naturais as cistatinas, que se ligam ao sítio ativo das catepsinas inibindo a sua atividade proteolítica. Contudo, existem evidências que o bacilo da tuberculose interfere com a atividade proteolítica do macrófago para aumentar a sua sobrevivência durante a infeção, diminuindo a atividade das catepsinas. O mesmo foi demonstrado ao nível da expressão genética das cistatinas, mas não existem estudos que comprovem que esse mecanismo afeta também a atividade inibitória das cistatinas nem o efeito no controlo da infeção. Uma possível via para contornar a reação adversa da micobactéria, seria através da manipulação das cistatinas, tornando-as interessantes alvo de estudo. A tuberculose é uma doença altamente associada à infeção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) uma vez que a consequente imunodeficiência provocada pela ação do vírus leva à disrupção do granuloma que contém a infeção por Mtb e disseminação do bacilo pelos tecidos. Um conjunto de moléculas utilizadas para o tratamento do HIV, são os inibidores da protease viral (IP). Já foi demonstrado experimentalmente que os IP influenciam a atividade das catepsinas durante a infeção pelo HIV. Assim sendo, estes inibidores podem ser potencialmente úteis na manipulação das catepsinas durante a infeção por outros agentes patogénicos, incluindo o Mtb a fim de contribuir para controlar esses infeções. O principal objetivo deste estudo foi investigar a interação entre cistatinas, Mtb e macrófagos, usando as cistatinas como ferramenta para manipular a proteólise por catepsinas durante a infeção e reforçar a resposta do hospedeiro na eliminação dos patogenos. Neste estudo, usamos metodologias de RNA de interferência (‘small interfering RNA; siRNA’) específicos para silenciar o RNAm para a cistatina C durante a infeção por Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) e Mycobacterium smegmatis. Esta cistatina é expressa em todos os tecidos e é o maior inibidor natural da catepsina S. Numa primeira fase, foi estudada a expressão génica da cistatina C durante a infeção por micobactérias através de PCR quantitativo (qPCR). Os nossos resultados mostram que a eficiência do silenciamento da cistatina C pela técnica usada em macrófagos, é cerca de 50% na redução dos níveis do RNA mensageiro comparativamente com os níveis obtidos no controlo, ou seja, em macrófagos nos quais foi usado um siRNA controlo inespecífico (scramble). As consequências do silenciamento ao nível da resposta inflamatória, especificamente por análise de ELISA da secreção de interlucina-1β (IL-1β) em macrófagos não infetados, comparativamente com macrófagos infetados com M. bovis BCG e M. smegmatis, indicam que com silenciamento da cistatina C concentrações de IL-1β aumentaram ainda mais. Também foi possível verificar diferenças entre macrófagos infetados com M. bovis BCG e M. smegmatis com e sem silenciamento da cistatina C. A análise da expressão dos marcadores apresentadores de antigénios à superfície dos macrófagos foi feita através da citometria de fluxo. O antigénio leucocitário humano tipo II (type II human leukocyte antigen, HLA-DR) foi usado nesta experiência pela sua capacidade de apresentar péptidos de bactérias fagocitadas aos linfócitos T. Os níveis de expressão foram analisados em macrófagos não infetados e macrófagos infetados com M. bovis BCG e M. smegmatis, com e sem silenciamento da cistatina C. Baixos níveis de expressão da HLA-DR foram observados em macrófagos infetados com M. bovis BCG, um efeito descrito em micobactérias patogénicas e que é comum quer ao Mtb quer ao BCG. No entanto, os macrófagos silenciados apresentaram uma restituição desses níveis da expressão da HLA-DR para níveis semelhantes a M. smegmatis, melhorando assim a resposta imune. A sobrevivência das micobactérias durante a infeção foi estudada através da contagem de unidades formadoras de colónias (colony-forming unit, CFU) em macrófagos infetados com M. bovis BCG e M. smegmatis, com e sem silenciamento da cistatina C. A infeção por micobactérias em macrófagos leva a um aumento da sua sobrevivência, mas ao manipularmos a cistatina C, silenciando-a, observamos que existe uma redução da sobrevivência das micobactérias apontando possivelmente para um aumento da atividade proteolítica e capacidade de matar o patogeno. Em paralelo, macrófagos infetados foram tratados com as inibidoras da protease viral do HIV (IP), especificamente saquinavir (SQV) e ritonavir (RTV), para estudar o seu efeito na modulação da resposta do hospedeiro após a infeção com M. bovis BCG. Foram analisados ao nível: da resposta inflamatória, através da análise da secreção da citoquina IL-1β; da expressão dos apresentadores deantigénios à superfície, usando o HLA-DR como antigénio de análise, e na sobrevivência da micobactéria através da contagem de unidades formadores de colónias. Quando as células infetadas foram tratadas com os IP, os resultados mostram que ao nível da resposta inflamatória, existe um aumento abruto da secreção da IL-1β quando infetadas com micobactéria comparativamente com as células não infetadas. No entanto, observaram-se diferenças significativas entre os tratamentos em células infetadas. No tratamento com RTV em macrófagos infetados, observou-se um maior aumento da secreção de IL-1β do que nos macrófagos infetados tratados com SQV. Na análise da expressão dos marcadores apresentadores de antigénios, os tratamentos levam a uma variação significativa da expressão do HLA-DR. Contudo verificou-se que o saquinavir modula a resposta positivamente, aumentando os níveis de expressão da HLA-DR à superfície da célula, enquanto o ritonavir diminuí os efeitos do mesmo. A contagem de unidades formadoras de colónias permitiu observar que ao longo do estudo, o tratamento com saquinavir diminuí a sobrevivência do M. bovis BCG, em contraste o tratamento com ritonavir aumenta significativamente a sobrevivência. No conjunto, os resultados obtidos no silenciamento da expressão da cistatina C levaram a um aumento da resposta pró-inflamatória por macrófagos infetados, tal como um aumento da capacidade do macrófago de expressar moléculas apresentadoras de antigénios à superfície da célula e um aumento na morte intracelular das micobactérias. Isto sugere que a manipulação das cistatinas, que regulam negativamente as catepsinas, podem ser uma ferramenta viável para potenciar as células hospedeiras, no controlo da atividade proteolítica melhorando a resposta imune contra a infeção e eliminarem as micobactérias. Os resultados obtidos pelos IP mostram que células tratadas com ritonavir diminuem a capacidade de expressão de apresentadores de antigénios e aumentam a sobrevivência da micobactéria, enquanto o tratamento com saquinavir aumentou a capacidade de expressar moléculas apresentadoras de antigénios à superfície e um aumento da morte das micobactérias, tornando o saquinavir um potencial alvo de estudo para o desenvolvimento de uma nova terapia contra Mtb