Production and characterization of a thermostable lipase from bacillus subtilis.

TEZ9026Tez (Yüksek Lisans) -- Çukurova Üniversitesi, Adana, 2011.Kaynakça (s. 79-100) var.xi, 101 s. : res. ; 29 cm.In this study, 27 bacterial strains isolated from the oil factory soil samples and identified as Bacillus sp. Eight of these strains (29,62%) showed lipolytic activity. Strain TKL-25 which showed the best lipase activity of these strains selected as the lipase producer. Strain TKL-25 showed the best lipase activity on a tributyrin plate (the largest hydrolysis zone) was selected as a producer of lipase and identified as Bacillus subtilis using VITEK-2 identification system. The best enzyme production (optimum conditions) took place at pH 10.0, 40°C. The enzyme was active at pH 4.0-9.0, 20-110°C, optimum activity was determined at pH 5.0, 80°C. After a treatment of 30 min. with five different buffer systems in the range of pH=3.0-10.0, residual activity of the enzyme was detected as 56% at pH 8.0, 43% at pH 3.6, 41% at pH 7.6. At the other pH buffers enzyme activity was conserved less than 30%. After a treatment of 30 min. at 50-120°C, activity of the enzyme was conserved 176% at 50°C, 209% at 160°C, 176% at 70°C, 192% at 80°C, 161% at 90°C, 171% at 100°C, 135% at 110°C, 124% at 120°C.Bu çalışmada yağ fabrikasından alınan toprak örneklerinden 27 bakteri suşu izole edilmiş, bunlar Bacillus sp. olarak tanılanmıştır. Söz konusu suşların 8 (%29,62) tanesi lipolitik aktivite göstermiştir. Tributyrin agarda en yüksek lipaz aktivitesi (en geniş hidroliz zonu) gösteren TKL-25 nolu izolat lipaz üreticisi olarak seçilmiş ve VITEK-2 tanılama sistemi ile Bacillus subtilis olarak tanılanmıştır. En iyi enzim üretimi (optimum koşullar) pH 10.0 ve 40°C'de gerçekleşmiştir. Enzim pH=4.0-9.0, 20-110°C aralığında aktivite göstermiş, optimum aktivite pH 5.0'de, 80°C'de saptanmıştır. pH=3.0-10.0 aralığında 5 farklı pH tamponu ile 30 dk. muamele sonrası enzimin kalan aktivitesi pH=8.0'de %56, pH=3.6'da %43, pH=7.6'da %41 bulunmuştur. Diğer pH koşullarında enzim aktivitesi %30'un altında korunmuştur. Enzim 50-120°C arasındaki sıcaklıklarda 30 dk. inkübasyona bırakıldıktan sonra, 50°C'de %176, 60°C'de %209, 70°C'de %176, 80°C'de %192, 90°C'de %161, 100°C'de %171, 110°C'de %135, 120°C'de %124 kalan aktivite görülmüştür. Enzim inhibitörler ve şelatörlerin 2 farklı konsantrasyonu ile 30 dk. Muamele edildiğinde aktivite farklı düzeylerde korunmuştur. Bunlar sırasıyla; PMSF (5 mM) %54, ?-merkaptoetanol (%0.5) %27, MgCl2 (5 mM) %23, CaCl2 (5mM) %21, MnCl2 (5 mM) %21, SDS %21 şeklindedir. Aktivite FeCl2 ile tamamen inhibe olmuştur. Enzim 2 farklı konsantrasyonda (%20-40) organik solventler ile 30 dk. Muamele edilmiştir. Lipolitik aktivite, %20 kloroform varlığında %9 indüklenmiş, %40 kloroform varlığında %68, %20 etanol varlığında %30, %20 metanol varlığında %24, %20 aseton varlığında %20, %40 gliserol varlığında %23 korunmuştur. %40 metanol, 2-propanol ve 2-butanol varlığında ise aktivite tamamen inhibe olmuştur. SDS-PAGE analizi ile 17.5 kDa moleküler ağırlığa sahip tek bir protein bandı saptanmıştır. Bacillus subtilis TKL-25 nolu suş mezofil, üretilen enzim asido-termofiliktermostabil karakter göstermektedir. Lipaz üreticisi suşun mezofil, üretilen enzimin termofil olması, fermentasyon prosesi süresince enerji gereksinimi bakımından, endüstriyel boyuttaki üretimlerde önemli bir avantaj sağlayacaktır.Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2010YL40