Cellulosimicrobium cellulans’a Ait β-1,3-Glukanaz Geninin Escherichia coli ve Lactobacillus plantarum’da Klonlanması ve Expresyonu

Giriş: Silaj, yeşil yem bitkilerinin anaerobik koşullar altında fermente edilerek saklanmasıyla elde edilen, besin madde bakımından oldukça zengin ve tercih edilebilir bir kaba yem kaynağıdır. Silaj açıldıktan sonra hava ile teması sonucu, silaj aerobik küf ve maya kontaminasyonuna maruz kalmakta ve sonuçta ciddi ekonomik kayıplar ve sağlık açısından riskler ortaya çıkmaktadır. Bu çalışmada Cellulosimicrobium cellulans’a ait β-1,3-glukanaz geninin Lactobacillus plantarum’da klonlanması ile aerobik bozulmayı önleyen rekombinant silaj inokülantının geliştirilmesi amaçlanmıştır. Gereçler ve Yöntem: Bu çalışmada β-1,3-glukanaz gen kaynağı olarak C. cellulans bakterisi kullanılmıştır. Gen PCR yöntemi ile bakterinin genomundan amplifiye edilmiştir. Klonlama vektörleri olarak pUC18 ve pTE353-2 plazmit DNA’ları kullanılmıştır. Geni taşıyan rekombinant plazmit DNA’ların Escherichia coli ve L. plantarum’a aktarılmasında sırasıyla CaCl2 transformasyonu ve elektroporasyon teknikleri kullanılmıştır. Rekombinant bakteriler uygun antibiyotik (amfisilin) ve substrat (laminarin) taşıyan besi ortamlarında Congo-red boyaması ile fenotipik larak test edilmişlerdir. Son olarak gen ürünleri zymogram analizinde donör bakteriye ait gen ürünü ile de karşılaştırılmıştır. Bulgular: Bu çalışmada C. cellulans’a ait β-1,3-glukanaz geni PCR ile amplifiye edilerek önce pUC18 plazmid DNA’sı aracılığıyla Escherichia coli’de, sonra da pUC18 ve pTE353-2 hibrid vektörü aracılığıyla da L. plantarum’da klonlanmıştır. PCR ve restriksiyon endonükleaz analizleri her iki plazmide de gen entegrasyonunun tamam olduğunu göstermiştir. Ayrıca β-1,3-glukan (laminarin) içeren selektif besiyerlerinde Congo-red boyaması ile her iki rekombinant bakteride de genin eksprese olarak enzimi ürettiği gösterilmiştir. Son olarak gen ürünleri orijinal bakteriye ait gen ürünü ile zymogram analizinde karşılaştırılmış ve aynı moleküler ağırlığa sahip oldukları gösterilmiştir. Sonuç ve Tartışma: Bu çalışma sonucunda maya hücre duvarını hidrolize eden β-1,3-glukanaz enzim geni L. plantarum’da klonlanarak rekombinant silaj inokülantı geliştirilmiştir. Elde edilen rekombinant kültürün silaj inokülantı olarak kullanılması ile silajda ki aerobik bozulmaların önüne geçilmesi, böylece meydana gelecek olan ekonomik zararların ve sağlık risklerinin ortadan kaldırılması umulmaktadır