Yabani Kemiricilerde Eski Dünya Hantavirus IgG Antikorlarının Saptanması için ELISA ve İmmünoblot Yöntemlerinin Optimizasyonu

Hantaviruslar, enfekte kemiricilerin salya, dışkı ve idrar gibi salgılarında bulunan virus partiküllerinin solunması ya da enfekte kemiricilerle direkt temas sonucu insanlara bulaşmaktadır. Ülkemizde, hantavirus tiplerinden Dobrava (DOBV), Puumala (PUUV), Saaremaa (SAAV), Tula (TULV) ve Seoul (SEOV) viruslarının taşıyıcısı olan kemirici türleri bulunmaktadır. Türkiye'deki kemiricilerde hantaviruslara özgül antikor varlığı, ilk kez 2004 yılında Karadeniz ve Ege bölgelerinden toplanan kemiricilerde gösterilmiştir. İlk renal sendromlu kanamalı ateş (RSKA) olguları ise 2009 yılında yine Karadeniz bölgesinden bildirilmiştir. Yaban hayatı ve sahadaki kemirici popülasyonlarında hantavirus prevalansının önceden belirlenmesi, hantaviruslara bağlı olguların durumu hakkında bilgi edinilmesi ve sahadaki risk durumunun ortaya konması açısından önem taşımaktadır. Kemiricilere ait örneklerin, DOBV ve PUUV gibi Avrasya'da sık görülen ve ülkemizde de görüldüğü bilinen bazı RSKA etkenleri açısından taranmasında kullanılabilecek şekilde optimize edilmiş bir ticari ürün bulunmamaktadır. Bu çalışmada, insan serumlarının taranması için üretilmiş, ticari enzim temelli immünolojik yöntem (ELISA) ve immünoblot testlerine ait antijenler kullanılarak, kemirici örneklerinde hantavirusa özgül antikorların taranmasına uygun testlerin optimizasyonu sağlanmıştır. ELISA (Anti-Hantavirus Pool ELISA; Euroimmun, Almanya) ve immünoblot (Euroline Anti-Hanta Profi le 1 strips; Euroimmun, Almanya) yöntemlerinin optimizasyonu için, en uygun serum ve konjugat dilüsyonları denenmiş ve ELISA yöntemi tarama, immünoblot yöntemi ise doğrulama amacıyla kullanılmıştır. Belirlenen bu prosedür ile, Apodemus ve Microtus türlerinden 84 kemiriciye ait serum örnekleri değerlendirilmiş ve elde edilen sonuçlar ile optimize edilen ELISA yönteminin eşik değeri, duyarlılık ve özgüllüğü saptanmıştır. ELISA yönteminin optimizasyonu için 1/50, 1/100 ve 1/200 serum dilüsyonları ile 1/10.000, 1/20.000 ve 1/40.000 konjugat dilüsyonları; immünoblot yönteminin optimizasyonu için ise 1/50 ve 1/100 serum dilüsyonları ile 1/5.000 ve 1/10.000 konjugat dilüsyonları değerlendirilmiştir. ELISA için "horseradish" peroksidaz enzimi ile işaretli keçi anti-fare IgG konjugatı, immünoblot için ise alkalen fosfataz ile işaretli keçi anti-fare IgG konjugatı kullanılmıştır. İnkübasyon süresi, yıkama sayısı ve substrat seçimi için üretici fi rmanın protokolü uygulanmıştır. ELISA yöntemi için 1/50 serum dilüsyonu ve 1/10.000 konjugat dilüsyonu, immünoblot için ise 1/100 serum dilüsyonu ve 1/5.000 konjugat dilüsyonu optimal değerler olarak belirlenmiştir. Optimize edilen ELISA yöntemiyle, belirlenen eşik değerine (ODantikor varlığı saptanmıştır. Doğrulama amacıyla kullanılan optimize immünoblot yöntemiyle ise, ELISA ile pozitif bulunan 22 örneğin -serum yetersizliği nedeniyle- 20'si çalışılmış ve 17'sinde DOBV antikor pozitifl iği saptanmıştır. Bu kemiricilerden 11'i Apodemus fl avicollis, üçü Apodemus agrarius, ikisi Microtus guentheri ve biri de Apodemus sylvaticus türlerine aittir. Her iki yöntem ile elde edilen sonuçlar karşılaştırıldığında, optimize ELISA yönteminin %100 duyarlılık ve %95 özgüllükte olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma ile kemirici serumlarının taranmasında kullanılabilecek, kolaylıkla ulaşılabilen ticari ürünlerden elde edilen antijenlerin kullanıldığı, hızlı ve güvenilir sonuç veren bir yöntem oluşturulmuştur. Benzer çalışmalar ile farklı türden kemiricilere yönelik olarak optimize edilecek serolojik yöntemler, alanda aktif izlem ve denetleme çalışmalarının gerçekleştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır.Hantaviruses infect humans via inhalation of viral particles in infected rodents' secretions such as saliva, urine and faeces or via direct contact with infected rodents. The rodent species that are known as the carriers of Dobrava (DOBV), Puumala (PUUV), Saaremaa (SAAV), Tula (TULV) and Seoul (SEOV) viruses are found in our country. The presence of specifi c antibodies against hantaviruses have been demonstrated in rodents collected from Black Sea and Aegean Regions of Turkey in 2004 for the fi rst time. The fi rst hantavirus-related hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) cases were reported in Black Sea region in 2009. The determination of the hantavirus prevalence in wild life and rodent populations in the fi eld is crucial for the information about hantavirus-related cases and to clarify the state of risk. There is no commercial product optimized for the screening of rodent serum samples in terms of HFRS agents like DOBV and PUUV that are widely seen in Eurasia as well as Turkey. In this study, the antigens belonging to the commercial enzyme-linked immunoassay (ELISA) and immunoblot tests that are produced for the screening of human sera were used for the development of antibody screening tests against hantavirus in rodent sera and were optimized. The most appropriate serum and conjugate dilutions were determined for the optimization of ELISA (Anti-Hantavirus Pool ELISA; Euroimmun, Germany) and immunoblot (Euroline Anti-Hanta Profi le 1 strips; Euroimmun, Germany) methods. Optimized ELISA method was used for the screening and optimized immunoblot method was used for the confi rmation. A total of 84 wild rodent sera that belonged to Apodemus and Microtus species were evaluated with this procedure and the cut-off value, sensitivity and specifi city of optimized ELISA method were determined. For the optimization of ELISA 1/50, 1/100 and 1/200 serum dilutions and 1/10.000, 1/20.000 and 1/40.000 conjugate dilutions were tested. For the optimization of immunoblot, 1/50 and 1/100 serum dilutions and 1/5.000 and 1/10.000 conjugate dilutions were tested. The horseradish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG for ELISA and the alkaline phosphatase conjugated goat anti-mouse IgG for immunoblot were used. We followed the manufacturer's recommendations for the incubation parameters, substrate and the number of washes. 1/50 serum dilution and 1/10.000 conjugate dilution for ELISA and 1/100 serum dilution and 1/5.000 conjugate dilution for immunoblot were determined as optimal concentrations. By using the optimized ELISA, 26.2% (22/84) of rodents were found positive for hantavirus antibodies according the determined cut-off value (OD450/620: 0.325). By using immunoblot as a confi rmatory test, 20 out of 22 ELISA positive samples could be studied because of the insuffi cient amount of sera and 17 of them was found positive in terms of DOBV antibodies. Of these rodents 11 were Apodemus fl avicollis, three were Apodemus agrarius, two were Microtus guentheri and one was Apodemus sylvaticus. When the results of ELISA were compared to immunoblot results, the optimized ELISA's sensitivity and specifi city were found as 100% and 95%, respectively. In this study, a method that can be used in the screening of rodent sera was constituted which uses commercial antigens that can be provided easily, gives fast and reliable results. Similar serological methods optimized for different types of rodents are of great importance for the realization of active follow-up and monitoring of the studies in the fi el