Post transcriptional Control of the Autoimmune Regulator (Aire) Gene by the MicroRNA-155

O timo é um órgão linfoide primário onde ocorre o estabelecimento da tolerância imunológica central pela eliminação de clones de linfócitos T auto reativos. Precursores de linfócitos T adentram o timo pela junção córtico-medular e são denominados de timócitos. Esses timócitos passam então por dois processos, a seleção positiva (que ocorre no córtex do timo e é mediada pelas células tímicas epiteliais corticais ou cTECs) e a seleção negativa (que ocorre na medula e é mediada pelas células tímicas epiteliais medulares ou mTECs). Durante a seleção positiva, somente os clones de timócitos duplo-positivos (DP) que expressam o receptor TCR?/?+ funcional (que reconhece moléculas de MHC) mais os marcadores CD4/CD8 (TCR?/?+, CD4+, CD8+) são exportados para a medula tímica onde ocorrerá a seleção negativa. Ela ocorrerá sobre os clones de timócitos simples positivos (SP) (TCR ?/?+ CD4+ ou TCR ?/?+ CD8+). As células mTEC expressam uma grande variedade de antígenos restritos a tecidos (TRA) e os apresentam para os timócitos SP. Aqueles clones que reconhecem com alta avidez e afinidade algum desses autoantígenos são deletados por apoptose e isso acaba evitando auto agressividade imunológica periférica. A propriedade das mTECs de expressar uma gama diversa de autoantígenos foi denominada de expressão gênica promiscua (PGE) a qual abrange virtualmente todos os antígenos dos tecidos do organismo. O significado da PGE é essencialmente imunológico e isso garante a representação dos constituintes próprios na glândula do timo e consequentemente o estabelecimento da tolerância imunológica central. O principal controlador da PGE é o gene Autoimmune Regulator (Aire), que age como um fator de transcrição não convencional e promove a expressão de milhares de mRNAs de TRAS nas mTECs. Além disso, Aire também controla a expressão de RNAs não codificadores, como os microRNAs. Os microRNAs são pequenos RNAs de fita simples (~22nt) que atuam no controle pós-transcricional através da degradação do mRNA ou da repressão da tradução. O gene Aire é um controlador transcricional e pós-transcricional nas células mTEC. Entretanto, pouco se conhece sobre como Aire é controlado. Uma das perguntasatuais, a qual foi explorada nesse trabalho, é se Aire poderia ser controlado por microRNAs. Para tentar responder a isso, fizemos uma análise in silico dos microRNAs que predizem hibridação com a região 3´UTR do mRNA de Aire do camundongo Mus musculus. O miR-155 prediz hibridação termodinamicamente estável entre os nucleotídeos 185 e 202 dessa região. Ele é um microRNA exônico que funciona em diferentes tipos celulares e regula diversos processos no sistema imunológico. Nosso trabalho focou então na avaliação funcional do controle pós-transcricional do miR-155 sobre o mRNA de Aire e suas consequências em células mTEC in vitro. A transfecção de células mTEC 3.10 com o miR-155 (mimic) resultou na redução nos níveis do mRNA e da proteína AIRE. Como esperado, a transfecção do miR-155 também resultou na modulação de um conjunto de mRNAs, incluindo aqueles que codificam TRAs, proteínas de adesão mTEC-timócitos, apoptose e splicing alternativo de mRNAs e citocinas de migração celular. As observações moleculares foram validadas experimentalmente quando demonstramos que o miR-155 modula a propriedade quimiotática das células mTEC sobre timócitos. Esses resultados mostraram pela primeira vez que Aire pode ser controlado pelo miR-155 e que esse microRNA também exerce ação ampla em células mTEC.The thymus is a primary lymphoid organ where the establishment of central immune tolerance occurs through the elimination of self-reactive T lymphocyte clones. Precursors of T lymphocytes (termed thymocytes) enter the thymus through the corticalmedullary junction. Thymocytes then undergo two processes, positive selection (which occurs in the thymus cortex and is mediated by cortical thymic epithelial cells or cTECs) and negative selection (which occurs in the medulla and is mediated by medullary thymic epithelial cells or mTECs). During positive selection, only CD4 / CD8 (TCR? / ?+, CD4+, CD8+) double positive (DP) expressing the functional TCR? / ?+ receptor (recognizing MHC molecules) are selected to migrate to the thymic medulla where negative selection will occur. It will occur on clones of simple positive (SP) thymocytes (TCR ? / ?+ CD4+ or TCR ? / ?+ CD8+). The mTEC cells express a wide variety of tissue-restricted antigens (TRA) and present them to SP thymocytes. Those clones that recognize some of these autoantigens with high avidity and affinity are deleted by apoptosis and this ends up avoiding peripheral autoimmune aggressiveness. The property of mTECs to express a diverse range of autoantigens was termed promiscuous gene expression (PGE), which encompasses virtually all of the body\'s tissue antigens. The significance of PGE is essentially immunologic and this ensures the representation of the self-constituents in the thymus gland and consequently setting up of central immunological tolerance. The main PGE controller is the Autoimmune Regulator (Aire) gene, which acts as an unconventional transcription factor and promotes the expression of thousands of TRAS mRNAs in mTECs. In addition, Aire also controls the expression of non-coding RNAs, such as microRNAs. MicroRNAs are small single stranded RNAs (~22nt) that act on posttranscriptional control through mRNA degradation or translation repression. The Aire gene is a transcriptional and post-transcriptional controller in mTEC cells. However, little is known about how Aire is controlled. One of the current questions, which was explored in this work, is whether Aire could be controlled by microRNAs. To try to respond to this, we performed an in silico analysis of the microRNAs that predicted hybridization with the3\'UTR region of the mouse (Mus musculus) Aire mRNA. The miR-155 predicts thermodynamically stable hybridization between the nucleotides 185 and 202 of that region. It is an exonic microRNA that works in different cell types and regulates various processes in the immune system. Our work focused on the functional evaluation of the post-transcriptional control of miR-155 on Aire mRNA and its consequences on mTEC cells in vitro. Transfection of mTEC 3.10 cells with miR-155 (mimic) resulted in reduction in mRNA and AIRE protein levels. As expected, miR-155 transfection also resulted in the modulation of a set of mRNAs, including those encoding TRAs, mTEC-thymocyte adhesion proteins, apoptosis, and alternative splicing of mRNAs and cell migration cytokines. Molecular observations were validated experimentally when we demonstrated that miR-155 modulates the chemotactic properties of mTEC cells on thymocytes. These results showed for the first time that Aire can be controlled by miR-155 and that this microRNA also exerts broad action on mTEC cells