Molybdenum Metabolism in Azotobacter vinelandii and its Biotechnological Applications

La fijación biológica de nitrógeno realizada por un grupo de microorganismos denominados diazotrofos es clave para las prácticas agrícolas sostenibles. Los diazotrofos usan nitrogenasas para reducir el N2 en NH3. Dependiendo de la composición metálica de sus cofactores en el sitio activo, las nitrogenasas se clasifican como Mo, V o Fe- nitrogenasas, que transportan FeMo-co, FeV-co o FeFe-co, respectivamente. Azotobacter vinelandii alberga los tres tipos de nitrogenasas, pero preferentemente expresa la Mo nitrogenasa ya que la presencia de molibdato en el medio reprime las otras dos. En esta tesis hemos realizado un análisis genético y bioquímico de la proteína de almacenamiento de molibdeno (MoSto) única en A. vinelandii que es codificada por los genes mosA y mosB. Debido a que MoSto permite la acumulación de enormes cantidades de Mo dentro de la célula, también hemos investigado su aplicación en el desarrollo de cepas de levadura fijadoras de N2. Mostramos que MoSto confiere a A. vinelandii una ventaja competitiva en situaciones de privación transitoria de Mo. También proporciona resistencia contra W, un metal que deteriora la actividad de las enzimas Mo, como la nitrogenasa. Además, MoSto amortigua los efectos reguladores de la reducción transitoria de Mo, evitando la desrepresión temprana de genes de las nitrogenasas alternativas. El Mo almacenado en MoSto es biológicamente activo ya que MoSto purificado reemplaza al molibdato en el ensayo de síntesis in vitro de FeMo-co. Las propiedades de MoSto lo convierten en un componente deseable para una ruta de ingeniería genética de Mo a la nitrogenasa en S. cerevisiae. De hecho, mostramos aquí que la expresión y el direccionamiento de MoSto a la matriz mitocondrial protegieron a S. cerevisiae de la toxicidad de Mo y además permitieron la maduración de NifQ coexpresado en una forma completamente activa. Como NifQ es el donante fisiológico de Mo para FeMo-co en A. vinelandii y otros diazotrofos, el logro de NifQ funcional completó la vía de Mo en las mitocondrias de S. cerevisiae. Por lo tanto, la vía Mo diseñada requirió, como mínimo, la incorporación de genes nifQ, mosA y mosB en el cromosoma. Los genes que codifican los transportadores de molibdato podrían ser necesarios bajo ciertos antecedentes genéticos de levadura o condiciones de crecimiento. ----------ABSTRACT---------- Biological nitrogen fixation carried out by a group of microorganisms termed diazotrophs is key to sustainable agricultural practices. Diazotrophs use nitrogenases to reduce N2 into NH3. Depending on the metal composition of their active-site cofactors, nitrogenases are classified as Mo, V or Fe-only nitrogenases, which carry FeMo-co, FeVco or FeFe-co, respectively. Azotobacter vinelandii harbors the three types of nitrogenases but it preferentially expresses the Mo nitrogenase as the presence of molybdate in the medium represses the other two. In this thesis we have performed a genetic and biochemical analysis of the A. vinelandii unique molybdenum storage protein (MoSto) encoded in mosA and mosB genes. Because MoSto enables the accumulation of enormous amounts of Mo inside the cell, we have also investigated its application in the development of engineered N2-fixing yeast strains. We show that MoSto confers A. vinelandii a competing edge in situations of transient Mo deprivation. It also provides resistance against W, a metal that impairs the activity of Mo-enzymes such as nitrogenase. Moreover, MoSto buffers the regulatory effects of transient Mo step-down, preventing early derepression of alternative nitrogenase genes. Mo stored at MoSto is biologically active as purified MoSto replaces molybdate in the in vitro FeMoco synthesis assay. The properties of MoSto make it a desirable component for an engineered Mo pathway to nitrogenase in S. cerevisiae. Indeed, we show here that expression and targeting of MoSto to the mitochondrial matrix protected S. cerevisiae from Mo toxicity and additionally permitted the maturation of co-expressed NifQ into a fully active form. As NifQ is the physiological Mo donor to FeMo-co in A. vinelandii and other diazotrophs, achieving functional NifQ completed the Mo pathway in S. cerevisiae mitochondria. Thus, the engineered Mo pathway required, at a minimum, the incorporation of nifQ, mosA and mosB genes into the chromosome and proper targeting of their products to mitochondria. Genes encoding molybdate transporters might be required under certain yeast genetic backgrounds or growth conditions