Paper de la Sintaxina-1 i els lipid rafts en guia axonal i regeneració neural

[cat] Durant el desenvolupament del sistema nerviós cal que les cèl·lules formades a una zona concreta migrin fins a la seva posició final o bé que projectin els seus axons per tal de contactar amb les seves cèl·lules diana. En aquest procés participen multitud de molècules de guia axonal i els seus receptors, que produiran l’atracció o la repulsió de l’axó, guiant-lo fins a la seva posició final. En aquest procés el conus de creixement té un paper clau ja que és on es localitzen la majoria d’aquests receptors i on es dona el recanvi de membrana a través de l’exocitosi i endocitosi, necessàries pel creixement de l’axó. En aquests processos de fusió de membrana participen les proteïnes SNARE, entre elles la Sintaxina-1. Una de les molècules guia més importants durant el desenvolupament del sistema nerviós és la Netrina-1. Aquesta molècula té diferents receptors i segons al receptor que s’uneixi provocarà atracció o repulsió. Estudis previs demostren que la la Sintaxina-1 interacciona amb un dels receptors de la Netrina-1, el DCC, i que aquesta interacció és necessària, durant el desenvolupament de la medul·la espinal, per a l’atracció de les neurones comissurals in vitro. Hi ha pocs estudis on s’investigui el paper de les proteïnes SNARE en guia axonal in vivo. Per aquesta raó, en aquesta tesi estudiem el paper de les proteïnes SNARE, específicament de la Sintaxina-1, en la guia axonal de les neurones comissurals, durant el desenvolupament de la línia mitja i la medul·la espinal, en tres models animals diferents (mosca, pollastre i ratolí). Per mitjà de la supressió dels gens de diferents proteïnes SNARE, demostrem que la Sintaxina-1 és necessària per la correcta guia axonal de les neurones comissurals i el correcte desenvolupament de la medul·la a les tres espècies. A més, confirmem que la pèrdua de funció de la Sintaxina-1 comporta una pèrdua de la sensibilitat de les neurones comissurals a les molècules de guia axonal Netrina-1 i Slit-2 i que la funció de la Sintaxina-1 està conservada en diferents processos de guia axonal com la repulsió depenent de Slit/ROBO a les neurones comissurals, i la repulsió depenent de Netrina-1/UNC5 a les neurones de la EGL. La majoria dels mecanismes involucrats en la guia axonal durant el desenvolupament són molt similars als processos que es donen durant la regeneració. Gran part dels receptors que participen en guia axonal i creixement estan localitzats en microdominis de membrana rics en esfingolípids i colesterol, anomenats lipid rafts, i la seva funcionalitat depèn de la correcta localització en aquests microdominis. A més el colesterol proporciona ordre i rigidesa a les membranes. Aquí demostrem com al disminuir el colesterol de les membranes incrementem el creixement neurític, l’àrea dels conus de creixement, la densitat dels fil·lopodis i la ramificació de neurones immadures del sistema nerviós central i perifèric cultivats in vitro. A més, demostrem que la pèrdua de colesterol afavoreix la regeneració de neurones hipocampals axotomitzades in vitro, de la via perforant en cultius organotípics i del nervi ciàtic in vivo. Finalment, també demostrem que la Nistatina, una droga àmpliament utilitzada per eliminar els lipid rafts de les membranes, incrementa la regeneració in vitro de neurones d’hipocamp activant l’enzim òxid nítric sintasa i, en conseqüència, incrementant els nivells d’òxid nítric.[eng] During the nervous system development neurons have to migrate and extend their axons to connect with their targets. In this process a huge amount of axon guidance molecules and their receptors participate to produce axon attraction or repulsion, guiding them to their final position. The growth cone has a key role in this process because the majority of receptors are localized in its surface and is where membrane turnover takes place. SNARE proteins are important components for membrane fusion in both, exocytosis and endocytosis, and their participation in axon guidance has been recently described. One important molecule during the nervous system development is Netrin-1. This guidance cue has different receptors and has the ability to produce attraction or repulsion depending on the receptor it binds. Recent studies have demonstrated that one of the SNARE proteins, Syntaxin-1, interacts with the Netrin-1 receptor DCC and that this interaction is necessary for the attraction of the commissural neurons. In this thesis we study the role of Syntaxin-1 during the commissural neuron guidance in three different animal models (fly, chicken and mouse). Deleting SNARE genes, we demonstrate that Syntaxin-1 is necessary for the correct commissural axon guidance and the correct spinal cord development in the three species. The mechanisms that regulate axon growth during development are very similar to processes that take place during axon regeneration. A variety of axon guidance receptors are localized in membrane microdomains enriched in cholesterol, termed lipid rafts, whose functionality depends on the proper localization within these microdomains. Here, we demonstrate that cholesterol depletion increases neurite growth, growth cone area, filopodia density and branching in immature neurons of the central and peripheral nervous system in vitro. Moreover, cholesterol depletion enhances axon regeneration after axotomy in vitro in dissociated hippocampal neurons, in slice organotypic cultures and in sciatic nerve in vivo. Finally, we also demonstrate that hippocampal regeneration in vitro is increased when nitric oxide synthase is activated by Nystatin treatments, a well-known drug used to disrupt lipid rafts from the cell membrane