Control of vascular integrity via endothelial growth factor and integrin cell adhesion receptor pathways

Vascular integrity is essential for proper vessel function, and for the maintenance of tissue and organ homeostasis. Endothelial cells (ECs) in the inner lining of the blood vessels form a barrier that dynamically regulates permeability across the vessel wall. Permeability via EC-EC junctions is transiently increased during inflammation, whereas abnormally or persistently elevated EC permeability promotes disease pathogenesis. For example, in sepsis, systemic capillary leakage compromises blood perfusion, and may lead to hypovolemic shock and multiorgan failure. Despite the significant amount of research on the mechanisms that control the EC barrier, no targeted therapies currently exist to seal the leaky vessels and maintain tissue perfusion. The aim of this study was to investigate how vascular permeability is controlled via an EC-derived growth factor angiopoietin-2 (ANGPT2), which is upregulated in various human diseases, including sepsis. ANGPT2 was found to signal via beta1-integrin, and therefore the function of endothelial beta1-integrin in vascular permeability was investigated. The results identified a novel signaling pathway, where ANGPT2–beta1-integrin signaling promotes EC permeability. Beta1-integrin was found to play a previously uncharacterized role in inflammation-induced vascular permeability, and an antibody against beta1-integrin inhibited vascular leakage, improved EC junction integrity and protected from cardiac failure in LPS-induced murine endotoxemia. Earlier studies have shown that ANGPT2 destabilizes blood vessel integrity in a context-dependent manner via its classical receptor TEK receptor tyrosine kinase (TIE2) on ECs. These studies have raised interest on ANGPT2 as a potential target in various diseases, including cancer and ocular neovascular diseases. This study revealed that ANGPT2 can promote EC destabilization independently of TIE2, which is downregulated during inflammation. These results suggest that a better understanding of the signaling function of ANGPT2 is necessary, in order to optimally target ANGPT2 in disease. This study also highlights the crucial role of endothelial beta1-integrin in controlling inflammation-induced EC permeability. The results showed that various inflammatory agents induced EC monolayer destabilization via beta1-integrin, manifested by the loss of junctional VE-cadherin, the formation of actin stress fibers, and altered EC-extracellular matrix (ECM) adhesions. The EC-ECM adhesions that formed in inflammation were elongated fibrillar adhesions that can be distinguished from focal adhesions by the presence of the adapter protein tensin-1. Furthermore, beta1-integrin promoted inflammation-induced EC contractility and reduced the EC barrier function. Importantly, targeting beta1-integrin using a monoclonal antibody, or via a heterozygous genetic deletion in the endothelium of gene-targeted mice decreased vascular leakage in LPS-induced murine endotoxemia. Notably, the beta1-integrin antibody was effective both as a prophylactic and as an intervention therapy, administered after the onset of systemic inflammation and vascular leakage, and its mechanism of action was independent of attenuating systemic inflammation, and of the vascular stabilizing function of TIE receptors. In summary, this thesis provides new knowledge on the mechanisms that lead to vascular leakage via ANGPT2 and beta1-integrin. Beta1-integrin was identified as a potentially universal regulator of EC permeability. A major finding was that targeting the EC beta1-integrin in a preclinical model of sepsis decreased vascular leakage, thereby improving cardiac function. The results of this thesis call for further studies in evaluating the translational potential of beta1-integrin mediated vascular permeability.Verisuoniston oikeanlainen toiminta on välttämätöntä kudosten ja elinten toiminnalle. Verisuonten sisäpinnan endoteelisolukerros muodostaa verisuonten sisäseinämän ylläpitäen kudosten tasapainoa ja immuunivastetta. Verisuonten endoteelisolukerroksen läpäisevyys lisääntyy tulehdusreaktiossa sekä monissa sairauksissa. Esimerkiksi sepsiksessä kapillaariverisuonten vuoto aiheuttaa nesteen kertymistä kudoksiin ja samalla heikentää veren virtausta ja kudosten hapen saantia, mikä voi johtaa septiseen sokkiin ja monielinvaurioon. Mittavasta tutkimustiedosta huolimatta kapillaarivuotoon ei toistaiseksi ole lääkettä, ja uusia keinoja verisuonivuodon estoon sairauksissa tarvitaan kipeästi. Tässä väitöskirjatutkimuksessa löydettiin uusi signaalinvälitysreitti, joka lisää verisuonten läpäisevyyttä tulehduksen yhteydessä. Prekliinisissä kokeissa verisuonten vuotoa pystyttiin estämään hiiren sepsis-mallissa. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää niitä solutason mekanismeja, jotka säätelevät endoteelisolujen läpäisevyyttä ja miten verisuonivuotoa voidaan estää prekliinisessä sepsis-mallissa. Tutkimus keskittyi erityisesti selvittämään endoteelisolujen angiopoietiini-2 (ANGPT2)-kasvutekijän sekä soluadheesioproteiinien, integriinien, merkitystä endoteelisolujen liitosten purkautumisessa ja verisuonivuodossa tulehduksessa. Tutkimuksessa löysimme uuden signaalinvälitysreitin, joka lisää endoteelisolukerroksen läpäisevyyttä. Endoteelisolujen väliset liitokset heikentyivät sekä ANGPT2- että beta1-integriini-välitteisen viestinnän seurauksena. Havaitsimme, että tulehduksen välittäjäaineet aktivoivat beta1-integriinin toimintaa, mikä johti soluliitosten heikkenemiseen. Lisäksi osoitimme, että tulehduksen aiheuttama verisuonivuoto oli vähäisempää hiiren sepsismallissa, jos toinen beta1-integriiniä koodaava alleeli oli poistettu hiiren endoteelisoluista tai jos beta1-integriinin toimintaa estettiin vasta-aineella. ANGPT2-kasvutekijän ennestään tunnetut tehtävät välittyvät endoteeliperäisen TIE2-reseptorin kautta. ANGPT2:n määrä lisääntyy monissa sairauksissa, ja ANGPT2 on lääkekehityksen kohteena erityisesti silmän verisuonisairauksien hoitoon. Tämä tutkimus osoitti, että ANGPT2 lisää endoteelisoluviljelmän läpäisevyyttä myös ilman TIE2-reseptoria, jonka määrä laskee tyypillisesti tulehduksessa. Työssä kuvasimme miten endoteelin läpäisevyys nousee ANGPT2-välitteisesti muuttuneen beta1-integriinin toiminnan seurauksena. Huomasimme, että ANGPT2–beta1-integriini-signaalinvälitys johti endoteelisoluliitosten heikkenemiseen, aktiinitukirangan muutokseen stressisäikeiseksi, sekä uudentyyppisten soluadheesioiden muodostumiseen lisäten endoteelisolukerroksen läpäisevyyttä tulehduksessa. Pre-kliinisessä sepsis mallissa beta1-integriiniä estävä vasta-aine vähensi merkittävästi verisuonivuotoa sekä estohoitona että interventiohoitona, kun vasta-aine annosteltiin systeemisen tulehduksen ja verisuonivuodon jo alettua. Vasta-ainehoito myös kohensi endoteelisoluliitoksia ja ehkäisi sepsiksen aiheuttamaa sydämen vajaatoimintaa. Mekanistisesti, beta1-integriini-vasta-aineen verisuonia parantavat vaikutukset eivät johtuneet yleisestä tulehduksen laskusta. Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä väitöskirjassa esitetään uutta tietoa endoteelisolujen läpäisevyyteen ja verisuonivuotoon johtavista mekanismeista. Tässä työssä kuvataan beta1-integriini endoteelisolujen läpäisevyyden säätelijäksi. ANGPT2 aktivoi beta1-integriinin johtaen adheesiomuutoksiin ja endoteelin läpäisevyyden nousuun. Lyhytaikainen beta1-integriini-vasta-ainekäsittely sekä yhden beta1-integriini-alleelin poisto vähensivät sepsiksen aiheuttamaa verisuonivuotoa ja suojasivat sepsiksen aiheuttamalta sydämen vajaatoiminnalta hiirimallissa. Väitöskirjatyön tutkimustuloksilla voi olla merkitystä kehitettäessä verisuonia vakauttavia hoitoja