A Spatio-Temporal Understanding of the Arabidopsis Root Development

The Arabidopsis root meristem consists of concentrically arranged tissues that surround the central vasculature. While the outer cell layers, the epidermis and ground tissue (GT), contribute to the radial symmetry of the entire root, the internal vasculature displays bilateral symmetry. These spatial patterns are established by the activity of stem cells located at defined positions within the stem cell niche. Daughter cells undergo cell expansion and differentiation to form shootward files along the longitudinal axis of the root. In the first part of this thesis, I describe GT specification and maturation. GT comprises the endodermis and cortex, and their lineages bifurcate following the asymmetric cell division (ACD) of the cortex-endodermis initial. The ACD requires the function of SHORT-ROOT (SHR) and its downstream regulator SCARECROW (SCR), which both belong to the GRAS transcription factor (TF) family. GA in the endodermis modulates the timing of GT maturation by promoting a second periclinal cell division which gives rise to an additional cortical layer between the endodermis and cortex. This additional cortex layer is named the middle cortex, and this process also requires SHR/SCR activity. Here, we have genetically and molecularly demonstrated that another GRAS member, SCARECROW-LIKE 3 (SCL3), is a direct downstream target of SHR/SCR, and its expression is also under the direct control of REPRESSOR OF ga1-3 (RGA), one of the DELLA proteins that are Gibberellin (GA) signaling inhibitors. SCL3 is expressed exclusively in the endodermis, where it integrates the SHR/SCR-mediated developmental signal and the GA-mediated hormonal signal to fine-tune the timing of middle cortex formation. The second part of my thesis investigates phloem sieve element (SE) development. SEs form a conductive tissue in the phloem that mediates the long-distance transport of sucrose. In Arabidopsis roots, protophloem SEs (PSE) comprise 20-25 cells from the stem cell to the enucleating cell. This cell file can serve as a model system to study tissue morphogenesis at single-cell resolution. Using confocal time lapse imaging technology, we monitored single-cell behaviors along the PSE lineage and defined five discernible stages: quiescent (stem cell), active division (transit amplifying cells), transition, differentiation and nuclear degradation (enucleation). We then focused on PSE differentiation, which involves dynamic cellular rearrangement ending with enucleation. We discovered a regulatory cascade in which ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT (APL) and two closely related NAC-domain containing TFs – NAC45 and NAC86 – play major roles. We also identified NAC45/86-DEPENDENT EXONUCLEASE-DOMAIN PROTEINs (NENs) that is involved in nuclear degradation downstream of the APL-NAC pathway. In order to comprehensively understand PSE development, we carried out phloem-specific transcriptome profiling by performing fluorescence activated cell sorting of various phloem reporter lines followed by RNA-seq. By analyzing the transcriptome data, we identified 925 phloem-abundant genes. We focused on a cluster of genes which initiate their expression early in the protophloem sieve element (PSE) lineage. Interestingly, this cluster includes six DOF transcription factor family members. Knocking out all six genes resulted in a very narrow vasculature and impaired phloem transport, indicating that these DOFs are required for phloem differentiation as well as specification. We also determined that these DOFs promote PSE differentiation by directly activating the APL pathway. As part of the root meristem, the PSE must differentiate in coordination with the surrounding tissues. In fact, defects in vascular tissue development often lead to systemic growth inhibition and even seedling lethality in extreme cases. In the final part of this thesis, I demonstrate that the global root meristem regulator PLETHORA (PLT) overrides DOF function in the early stages of phloem development by suppressing the expression of APL, thereby preventing premature PSE differentiation.Lituruohon (Arabidopsis) juurenkärjen kasvuvyöhyke koostuu samankeskisesti järjestäytyneistä solukerroksista, jotka ympäröivät johtosolukon sisältävää keskuslieriötä. Pääjuuren pinnassa oleva solukerros sekä sen alainen kuorisolukko ovat säteittäin symmetriset, kun taas keskuslieriö on peilikuvamaisesti eli bilateraalisesti symmetrinen. Nämä kolmiulotteiset rakenteet muodostuvat juuren kärkikasvusolukossa sijaitsevien kantasolujen jakaantumisen, laajenemisen ja erilaistumisen seurauksena. Väitöstyöni ensimmäisessä osassa tutkin lituruohon kuorisolukon syntyä ja kehitystä. Varhaisessa vaiheessa kuorisolukko muodostuu kahdesta solukerroksesta, ulompi ns. cortex ja sisempi endodermi, joiden kehitys haarautuu yhteisen kantasolun epäsymmetrisen jakautumisen jälkeen. Kyseiseen solunjakautumiseen tarvitaan GRAS geeniperheeseen kuuluvat transkriptiotekijät SHORT-ROOT (SHR) ja SCARECROW (SCR). Myöhemmin SHR/SCR, yhdessä endodermistä käsin vaikuttavan kasvihormoni gibberelliinin kanssa, on keskeinen tekijä toisen, pinnansuuntaisen solunjakautumisen ajoittumisessa cortexin ja endodermin välille. Tämän solunjakautumisen myötä muodostuvaa keskimmäistä kuorisolukon kerrosta kutsutaan nimellä middle cortex. Väitöstyöni osoitti että GRAS geeniperheeseen kuuluva SCARECROW-LIKE 3 (SCL3) on myös tärkeä middle cortex solukerroksen oikea-aikaisessa muodostumisessa, kanavoiden suoraan sekä yllämainittuja transkriptiotekijöitä että hormonaalista säätelyä. Todistimme geneettisin ja molekyylibiologisin menetelmin että SCL3 aktivoituu endodermissä sekä SHR/SCR että gibberelliinin signaalivälitystä estävän proteiinin REPRESSOR OF GA1-3 (RGA) suoranaisesta vaikutuksesta. Väitöstyöni toinen osio käsittelee nilan siiviläputkien kehitystä, jota tarvitaan sokerien pitkänmatkan kuljettamiseen kasvissa. Siiviläputkien esiasteet, ns. protonila siiviläelementit (PSE) muodostavat lituruohon juurenkärjessä morfologisesti määritettynä 20-25 solun mittaisen jonon, laskien kärjimmäisenä sijaitsevasta kantasolusta aina siihen soluun jonka tuma hajoaa erilaistumisprosessin edistyessä. Olemme tutkineet siiviläputkien esiasteita yksittäisen solun tarkkuudella, kuvaten solujonoja konfokaalimikroskoopin avulla elävissä kasveissa ajan funktiona. Määritimme viisi kehitysvaihetta jotka edeltävät toiminnallisen siiviläputken muodostumista: harvoin jakautuva kantasolu, pinnanvastaiseen suuntaan jakautuvat solut, siirtymävaihe, erilaistuminen jolloin soluelimet uudelleenjärjestyvät, ja lopulta tuman hajoaminen. Löysimme myös erilaistumisvaiheelle tärkeän säätelyreitin, joka perustuu ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT (APL) sekä kahden muun NAC transkriptiotekijän, NAC45 ja NAC86, toimintaan. Lisäksi tunnistimme ryhmän proteiineja (NAC45/86-DEPENDENT EXONUCLEASE-DOMAIN PROTEIN, NEN), jotka ovat osallisena siiviläputken erilaistumisvaiheen huipentamassa tuman hajoamisessa. Seuraavaksi hyödynsimme lajittelevaa virtaussytometriaa, jonka avulla erottelimme fluoresoivalla leimalla merkityt, tietyissä PSE kehitysvaiheissa ilmenevät solut toisistaan, ja analysoimme laajamittaisesti geenien ilmenemistä kyseisissä soluissa. Määritimme 925 geeniä jotka ilmenivät erityisesti nilassa. Keskityimme erittäin varhaisessa kehitysvaiheessa ilmeneviin geeneihin, joiden joukosta poimimme kuudesta DOF transkriptiotekijästä koostuvan ryhmän. Kaikkien kuuden DOF geenin toiminnan estäminen kasvissa yhtäaikaisesti johti johtosolukon huomattavaan kapenemiseen ja nilan toiminnan heikentymiseen, mistä päätellen kyseiset geenit ovat välttämättömiä nilan erilaistumisen ja synnyn kannalta. Havaitsimme myös että nämä DOF transkriptiotekijät edesauttavat siiviläputkien esiasteiden erilaistumista suoraan aktivoimalla APL säätelyreittiä. Juurenkärjen kasvuvyöhykkeen keskeisenä osana nilan siiviläputkien erilaistumisen on tapahduttava koordinoidusti ulompien solukerrosta kanssa. Häiriöt johtosolukon kehittymisessä aiheuttavat usein laajamittaisen kasvun estymisen ja jopa kasvin kuoleman. Väitöstyöni viimeisessä osassa havainnollistan, että kasvuvyöhykkeessä kauttaaltaan vaikuttava, entuudestaan tunnettu transkriptiotekijä PLETHORA (PLT) syrjäyttää DOF toiminnan vaimentamalla APL geenin ilmenemistä, ja siten estää siiviläputkien ennenaikaista erilaistumista juuren kärjessä