Extrakorporale Blutreinigung bei Sepsis und Leberversagen

Extrakorporale Blutreinigungssysteme werden verwendet, um Substanzen aus dem Blut von Patienten durch Filtrations- oder Adsorptionseinheiten zu entfernen. Bekanntestes Beispiel ist die chronische Dialyse bei chronischer Niereninsuffizienz. Diese langfristige bis lebenslange Behandlung ermöglicht Patienten mit schwacher oder keiner Nierenleistung ein Überleben bzw. eine beschwerdearme Wartezeit, bis ein geeignetes Transplantat zu Verfügung steht. In den letzten Jahrzehnten wurden Anstrengungen unternommen, auch bei Leber- und Sepsiserkrankungen extrakorporale Blutreinigungsverfahren als unterstützende Therapie zu verwenden. Zusätzlich zur Dialyse kommen Adsorber zum Einsatz, welche die Entfernung von Protein-gebundenen und hochmolekularen Substanzen aus dem Blut ermöglichen. Zielsubstanzen bei der extrakorporalen Leber- und Sepsistherapie sind unter anderem Bilirubin, Gallensäuren, Endotoxine, Zytokine und andere Entzündungsmediatoren. Ziel dieser Arbeit war es, bestehende und neue, als Medizinprodukt noch nicht zugelassene Adsorber, hinsichtlich ihrer Effektivität und Blutverträglichkeit mit Hilfe von in vitro-Experimenten zu testen. Des Weiteren wurden Kombinationen von bestehenden Blutreinigungsverfahren für eine effizientere Behandlungsmöglichkeit bei Leber- und Sepsis-Erkrankungen untersucht. Adsorptionsstudien mit kommerziell erhältlichen Endotoxinadsorbern wurden in Serum, Plasma und Blut mit Hilfe von Batchtests durchgeführt. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Endotoxin-Inaktivierung durch die Verwendung von Polymyxin B (PMB), einem Antibiotikum mit hoher Affinität zu Endotoxinen, eine geeignete Alternative zu den Endotoxinadsorbern darstellt. Polystyrol-Divinylbenzol basierte Adsorber mit unterschiedlichen Porengrößen wurden hinsichtlich Effizienz und Biokompatibilität mit kommerziell erhältlichen Zytokinadsorbern verglichen. Neben der Plasma- und Blutverträglichkeit wurde mit Hilfe von Batchtests in Plasma die adsorptive Entfernung ausgewählter Antibiotika untersucht. Zusätzlich wurde getestet, ob durch die Anwendung der regionalen Zitratantikoagulation anstatt von Heparin die Blutverträglichkeit in extrakorporalen Blutreinigungsverfahren gesteigert werden kann. Die Poren von Adsorbern wirken als Molekularsieb und verhindern das Eindiffundieren von Molekülen, die größer als der Porendurchmesser sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass bei Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer basierenden Adsorbern 15 nm Poren für die Zytokin-Entfernung am geeignetsten sind. Hingegen sind für die Entfernung von Albumin-gebundenen Toxinen aus dem Blut Poren zwischen 30 und 40 nm am effektivsten. Poren mit noch größerem Durchmesser verringern die selektive Wirkung von Adsorbern und führen zu einer unkontrollierten Adsorption von allen Plasmaproteinen. Dadurch sind letztere nicht plasmakompatibel und erfüllen somit nicht die Anforderungen für die Verwendung in der extrakorporalen Blutreinigung. Die Blutverträglichkeit, Selektivität und Effizienz von Adsorbern, welche in der Blutreinigung eingesetzt werden, können somit durch die richtige Wahl der Porenverteilung verbessert werden. Bei der adsorptiven Entfernung von Zytokinen aus humanem Plasma zeigte der Adsorber CG161 die größte Effizienz. Zusätzlich konnte dieser Adsorber im Gegensatz zu den in der Klinik eingesetzten Adsorbern auch TNF-α großteils entfernen. In separaten in vitro-Experimenten konnte gezeigt werden, dass Adsorber, die in der Blutreinigung zu Anwendung kommen, den Serumspiegel von ausgewählten Antibiotika adsorptiv reduzieren. Für ein besseres und sicheres Antibiotika-Monitoring in der extrakorporalen Leber- und Sepsis-Behandlung müssen weitere Untersuchungen zur Bestimmung der Clearance von Antibiotika während der extrakorporalen Therapie durchgeführt werden. In Adsorptions- und Filtrationsexperimenten mit Blut konnte gezeigt werden, dass die Zitratantikoagulation im Vergleich zu Heparin die Bioverträglichkeit von Materialien, welche in der Blutreinigung zur Anwendung kommen, deutlich verbessert. Von allen in dieser Arbeit untersuchten Endotoxinadsorbern zeigte die DEAE-Sepharose die effektivste Endotoxin-Elimination. DEAE-Sepharose kann jedoch durch seine schlechte Bioverträglichkeit in Blut und Plasma nicht eingesetzt werden. Von den übrigen Adsorbern konnten nur die PMB basierenden Adsorber eine Endotoxin-Reduktion bewirken. Jedoch konnte auch gezeigt werden, dass die Abnahme der LPS-Aktivität durch desorbiertes PMB verursacht wurde, welches Endotoxine als LPS-PMB-Komplex bindet. Liegen Endotoxine in Form des LPS-PMB-Komplexes besitzen eine geringere Immun-stimulierende Wirkung im Blut und führen dort zu einer stark reduzierten Zytokinsekretion durch Leukozyten. Auf Grund der in vitro Ergebnisse konnten wir zeigen, dass der ideale PMB-Serumspiegel für die LPS-Inaktivierung zwischen 100 und 200 ng/ml liegt. Durch die Beschichtung des Zytokinadsorbers CG161 mit PMB konnte die adsorptive Zytokinentfernung und eine kontinuierliche PMB-Freisetzung durch ein und denselben Adsorber erreicht werden. Eine neue extrakorporale Therapiemöglichkeit für die Gram-negative Sepsis könnte durch eine Kombination von bestehenden und neu entwickelten Verfahren sein. Dieses könnte sich zusammensetzen aus: 1. Einem Zytokinadsorber, der auch in der Lage ist Protein-gebundene Toxine aus dem Blut zu entfernen. 2. Einem Verfahren, welches die immunstimulierende Eigenschaft von Endotoxinen inaktiviert. Dies kann durch eine kontinuierliche Polymyxin Infusion oder durch einen Polymyxin-beschichteten Adsorber erreicht werden. 3. Einem High-Cut off Filter, welcher effizient urämische Toxine entfernt und zusätzlich kleine bis mittelmolekulare Entzündungsmediatoren entfernt. 4. Einer regionalen Zitratantikoagulation, welche die Plasma und Blutverträglichkeit der Materialien verbessert. Weitere in vitro-Versuche müssen noch folgen, um einen sicheren Einsatz in der Klinik zu ermöglichen.Extracorporeal blood purification systems are used to remove substances from the blood of patients through filtration or adsorption units. The best-known extracorporeal blood purification system is the chronic dialysis which is used in chronic renal failure. This long-term to lifelong treatment enables patients with weak or no kidney function to survive or prolong life until a suitable transplant is available. In recent decades, efforts have also been made to use extracorporeal blood purification methods as a supportive therapy for liver failure and sepsis. In addition to dialysis, adsorbents are used to remove protein-bound and large molecular substances from the blood. Target substances in extracorporeal liver support and sepsis therapy are, among others, bilirubin, bile acids, endotoxins, cytokines and other inflammatory mediators. This work aimed to test by in vitro experiments existing and new adsorbents, which are not approved as a medical device, for their effectiveness and blood compatibility. Furthermore, combinations of existing blood purification methods were tested to develop an efficient extracorporeal blood purification system for liver and sepsis therapy. Adsorption studies with commercially available endotoxin adsorbents were conducted in serum, plasma, and blood. Also, it has been investigated whether endotoxin inactivation by the use of Polymyxin B (PMB), an antibiotic with a high affinity for endotoxins, is a suitable alternative to endotoxin adsorbent. Polystyrene-divinylbenzene based adsorbents with different pore sizes and clinically approved cytokine adsorbents were studied regarding their efficiency and biocompatibility. In addition to plasma and blood compatibility, the adsorptive removal of selected antibiotics by liver support methods was investigated. Also, it was tested whether the use of regional citrate anticoagulation instead of heparin increases blood compatibility in extracorporeal blood purification processes. The pores of adsorbents act as molecular sieves and prevent the passage of molecules larger than the pore diameter. The results of this study show that polystyrene-divinylbenzene copolymer-based adsorbents with 15 nm pores are most suitable for cytokine removal. On the other hand, pores between 30 and 40 nm are more effective for the removal of albumin-bound toxins from plasma. Pores with larger diameters reduce the selective effect of adsorbents and lead to uncontrolled adsorption of all plasma proteins. As a result, they are not plasma-compatible and therefore do not meet the requirements for use in extracorporeal blood purification systems. The blood tolerance, selectivity, and efficiency of adsorbents used in blood purification can thus be improved by the right choice of pore distribution. The adsorbent CG161 showed the highest efficiency in the adsorptive removal of cytokines from human plasma. Also, this adsorbent was able to remove a large part of TNF-α in contrast to the adsorbents used in the clinic. In separate in vitro experiments, we were able to show that adsorbent used in blood purification reduce the serum levels of selected antibiotics. For better and safer antibiotic monitoring in the extracorporeal treatment of liver failure and sepsis, further investigations must be carried out to determine the clearance of antibiotics during extracorporeal therapy. We could show in adsorption and filtration experiments with human blood that citrate anticoagulation significantly improves the biocompatibility of materials used in blood purification systems compared to heparin. Among all endotoxin adsorbents which were studied for endotoxin removal, DEAE sepharose was the most effective one. However, DEAE sepharose cannot be used in blood and plasma due to its poor biocompatibility. Only PMB-based adsorbents were able to reduce endotoxin levels. However, it could be shown that the decrease in LPS activity was caused by desorbed PMB which binds endotoxins and forms a LPS-PMB complex. When endotoxins are presented in the form of the LPS-PMB complex, they have a lower immune stimulating effect in blood and lead to a strongly reduced cytokine secretion by leukocytes. Based on in vitro results, we were able to show that the ideal PMB serum level for LPS inactivation is between 100 and 200 ng/ml. Additionally we coated the CG161 adsorbent with a defined amount of PMB by hydrophobic interaction. In blood and plasma, an equilibration between the free and bound form of PMB leads to a constant PMB level in plasma. Our in vitro experiments showed that the combination of cytokine removal and controlled PMB release by the same adsorbent can be realized. A new option for extracorporeal therapy in gram-negative sepsis could be realized by a combination of existing and newly developed procedures. These are: 1. A cytokine adsorbent that removes protein-bound toxins from the blood. 2. A process that inactivates the immunostimulatory properties of endotoxins. This can be achieved by continuous Polymyxin infusion or by a Polymyxin coated adsorbent. 3. A high cut-off filter that efficiently removes uremic toxins and small to middle molecular weighted inflammation mediators. 4. Regional citrate anticoagulation that improves plasma and blood tolerance of materials. Further in vitro tests are necessary to ensure a safe testing in the clinic