Systematische funktionelle Analyse der Wsc- und Mid-Sensorfamilie in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Wie alle Lebewesen muss sich der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae an eine stetig verändernde Umwelt anpassen. Dafür benötigt der Pilz Sensorsysteme, die verschiedene äußere Einflüsse erkennen, sodass er mit einer adäquaten Zellantwort reagieren kann. Umweltbedingungen, die Einfluss auf die Zellwand von S. cerevisiae nehmen, werden von den Sensoren und Proteinen des konservierten Zellwandintegritäts-Signalweg („Cell Wall Integrity-Pathway“, CWI) erkannt und weiterverarbeitet. Zu diesen Zellwand-beeinträchtigenden Bedingungen können unter anderem sowohl chemische, als auch mechanische Stresse gehören. Die CWI-Sensoren aus S. cerevisiae können in die Wsc- und Mid-Familie aufgeteilt werden. Zu den Wsc-Sensoren werden die Proteine Wsc1, Wsc2 und Wsc3 gezählt, die sich durch eine für die Funktion essentielle Kopfgruppe, der Wsc- oder Cystein-reichen Domäne (CRD) auszeichnen. Diese ist in der zweiten Gruppe der CWI-Sensoren, den Mid-Proteinen Mid2 und Mtl1, nicht vorhanden. In dieser Arbeit sollte zum einen untersucht werden, ob sich eine spezifische Funktion der fünf Sensoren im ∑1278b-Stammhintergrund von S. cerevisiae feststellen lässt. Dafür wurden Mutanten konstruiert, die nur noch einen oder keinen aktiven CWI-Sensor trugen. Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass Zellen dieses Stammhintergrunds unter Normalbedingungen auch ohne die fünf Proteine überleben konnten. Zudem wurde festgestellt, dass Wsc1 nicht für die Resistenz gegen Koffein und Caspofungin benötigt wird, aber Zellen, die Kongorot-Stress ausgesetzt wurden, nur überleben konnten, wenn Wsc1 vorhanden war. Im Gegensatz dazu wird die CWI-Kinase Slt2 in ∑1278b nicht zur Signalweiterleitung bei diesem Stress verwendet. Außerdem konnte eine Funktion von Wsc1 bei Biofilmbildung auf halbfestem Medium bestätigt werden, welche jedoch Nährstoff-abhängig zu sein scheint. Für Wsc2 wurde eine unterstützende Rolle der Überlebensrate der Hefezellen bei verschiedenen Zellwandstressen erkannt. Für die anderen Sensoren konnte keine spezifische Funktion gezeigt werden, jedoch wurde eine gegenseitige Einflussnahme der Sensoren vermutet und eine Funktion aller Sensoren bei der Adhäsion, dem Pseudhyphenwachstum, DNA-, reduktivem oder Aminosäurestress ausgeschlossen. Zudem wurden in verschiedenen Stammhintergründen von S. cerevisiae Unterschiede in der Sensortätigkeit und Signalweiterleitung des CWI aufgezeigt. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte aufgeklärt werden, ob gruppierte aromatische Aminosäuren, die an der Oberfläche der CRD-Kristallstruktur von Wsc1 liegen, essentiell für die Funktion des Sensors sind. Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten aromatischen Aminosäuren wichtig für die Resistenz der Zellen gegen die chemischen Zellwandstresse Kongorot und Caspofungin sind. Zudem sorgen Austausche dieser Aminosäuren, ähnlich wie bei Mutationen in den konservierten Cystein-Resten der Domäne, für eine verstärkte Verlagerung der Sensoren ins Zellinnere.As all living organisms, the microorganism Saccharomyces cerevisiae has to adapt to a constantly changing environment. For this purpose, the fungus needs sensing systems, which help to recognize the outer impacts and to properly react to them. Cell wall disturbing environmental conditions are recognized and processed by the yeast sensors and proteins of the conserved Cell-Wall-Integrity pathway (CWI). These conditions are for example mechanical or chemical stresses, which are sensed by the CWI-proteins of the Wsc- and Mid-family. The Wsc protein group consists of the sensors Wsc1, Wsc2 and Wsc3, which are characterized by the essential head group, called Wsc- or cysteine-rich domain (CRD). In the second group, the Mid-proteins with Mid2 and Mtl1, this CRD is not found. One aim of this work was to clarify, if the five CWI-sensors had specific functions in cells of the yeast strain ∑1278b. In favour of that, mutant strains with only one or no active sensor were constructed. It was shown, that cells without any sensor were able to grow without osmotic support. In addition to that, ∑1278b Wsc1 was identified to be unnecessary for providing resistance to Caspofungin and caffeine, but important for sensing the cell wall stressor Congo Red. In contrast, the important CWI-kinase Slt2 was not needed for signal transduction in presence of this chemical stress compound. On top of that, a Wsc1 function in biofilm formation on semi-solid surfaces was confirmed, thought this function seemed to be nutrient dependent. Wsc2 showed a supporting role in survival rate of the stress exposed yeast cells. None of the other sensors revealed any specific function, however a mutual influence of all sensors was indicated and a sensor function in adhesion, pseudohyphal growth, DNA-, reductive or amino acid-stress was excluded. Moreover, this work uncovered differences in sensing and signal transduction of the CWI in different strain backgrounds of S. cerevisiae. Furthermore, it should be analysed, if clustered aromatic residues, which are exposed on the surface of the Wsc1 CRD-structure, were needed for sensor function. It was shown, that the investigated amino acid clusters were essential for the resistance of yeast cells exposed to the chemical cell wall stresses Congo Red or Caspofungin. On top of that, the exchanged amino acids led to a localization shift of the sensors into the cytoplasm, which was previously shown for Wsc1-sensors with mutations in the conserved cysteine residues in a similar way