Matrixmetalloproteasen 1, 2, 3, 9, 13 - und Kollagen Typ VI - mRNA-Expression humaner Chondrozyten in verschiedenen räumlichen Organisationsformen

Die Arthrose (Osteoarthritis/OA) ist eine bis heute noch unvollständig verstandene Erkrankung und es stehen demnach keine kausal oder präventiv wirkenden biologischen Therapien zur Verfügung. Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag dazu, die Pathophysiologie der OA-assoziierten Gewebezerstörung des Gelenkknorpels besser zu verstehen, um auf dieser Basis weitergehende Forschungseinblicke zu ermöglichen und ggf. therapeutische oder präventive Ansatzpunkte für die OA zu finden. Die vorliegende Arbeit fokussierte sich auf die superfizielle Schicht des Knorpels distaler humaner Femurkondylen des Kniegelenks, da diese Schicht früh im Krankheitsverlauf von OA-typischen Veränderungen betroffen ist und somit relevant für ein besseres OA-Verständnis ist. Humane superfizielle Chondrozyten bilden verschiedene komplexe räumliche Anordnungsmuster, die gelenkspezifisch sind und sich in der Früh-OA charakteristisch verändern. Diese Anordnung ist eng mit der perizellulären Matrix (PZM) assoziiert, welche funktionell relevant ist und mit fortschreitendem Verlust der räumlichen Organisation in fortgeschrittenen OA-Stadien strukturell verloren geht. Eines der Hauptkomponenten der PZM ist Typ VI Kollagen, welches durch MMP-2, -9 und auch MMP-3 prinzipiell abgebaut werden kann, wie es an anderen Geweben bereits gezeigt wurde. Somit ist es theoretisch denkbar, dass ein Abbau der Typ VI Kollagen-Komponente der PZM am strukturellen Schaden der PZM beteiligt sein könnte. In diesem Kontext stellt sich die, in der vorliegenden Arbeit untersuchte Frage, ob eine MMP-2 und/oder MMP-9 bzw. MMP-3 mRNA-Expression im humanen hyalinen Knorpel nachzuweisen ist, und ob eine solche mRNA-Expression mit spezifischen Stadien der räumlichen Anordnung superfizieller Chondrozyten im hyalinen Gelenkknorpel assoziiert ist. Methodisch wurden standardisierte Knorpelexplantate inklusive der superfiziellen Schicht humaner Femurkondylen hergestellt. Die räumlichen Organisationsstadien der Explantate wurden fluoreszenzmikroskopisch visualisiert und zur stadienspezifischen Sortierung der Explantate verwendet. Anschließend wurde die mRNA-Expression von Typ VI Kollagen (Col6A3) in Kombination mit den knorpelrelevanten MMPs MMP-1, -2, -3, -9 und -13 mittels qRT-PCR untersucht und statistisch ausgewertet. Weiterhin wurde die Visualisierung der PZM näher untersucht. Hier ist es üblich, Typ VI Kollagen durch Fluoreszenzmikroskopie mittels eines Antikörper-Systems darzustellen. Hierbei gehen Chondrozyten allerdings zugrunde und falsch positive Ergebnisse durch Kreuzreaktivität mit anderen Epitopen sind möglich. Deshalb wurde hier untersucht, ob die PZM durch Autofluoreszenz nachweisbar ist. Unabhängig von der Chondrozytenorganisation war die mRNA-Expression von MMP-2, -3 und -9 in OA-Chondrozyten stets in allen Explanaten nachweisbar, während die Expression von MMP-1, -13 und von Col6A3 nur in etwa 60% nachweisbar war. Signifikante Korrelationen zwischen den mRNA-Expressionen lag nur in wenigen Fällen vor, vor allem zwischen MMP-1 und Col6A3 und zwischen MMP-13 und Col6A3. Interessanterweise ergab die mRNA Analyse für alle Zielgene charakteristische Expressionsprofile für einzelne Stadien der räumlichen Organisation Strings (S), Double Strings (DS), Small Cluster (SC), Big Cluster (BC) und Diffuse (D). Die mRNA-Expression von MMP-2 war in den Stadien S, DS, SC und BC gering, aber im diffusen Stadium D signifikant höher als in allen anderen Organisationsformen. Verglichen mit S, DS, SC und BC entsprach das einem Anstieg um das 294-fache. Die mRNA-Expression von MMP-9 war in allen Stadien nachweisbar und in der räumlichen Organisation BC signifikant höher als in S, SC und D. Die mRNA von MMP-3 wurde in fast jeder Probe signifikant stärker als alle anderen untersuchten mRNAs exprimiert und die mRNA-Expression von MMP-2 und MMP-1 zeigte meist signifikant geringere Expressionsraten im Vergleich zu allen anderen Zielgenen. Die mRNA von Col6A3 war in der räumlichen Organisation S niedrig und nahm in den darauffolgenden Organisationsstadien von DS zu D signifikant zu. Die MMP-9 und MMP-13 mRNA-Expression war bereits mit frühen Organisationsveränderungen (DS) signifikant verstärkt. Zum Thema der Autofluoreszenzdarstellung der PZM wurde erarbeitet, dass native Knorpelgewebe humaner Femurkondylen im grünen Spektralbereich sichtbaren Lichts (470nm) autofluoreszieren, und dass eine PZM-artige Struktur mit und ohne Primär-/Sekundärantikörperverwendung sichtbar war. Hieraus wurde geschlossen, dass Sekundärantikörperfärbungen der PZM im grünen Spektralbereich mit der Problematik falsch positiver Resultate behaftet sein könnten. Der rote Spektralbereich zeigte ein solches Phänomen nicht, so dass dieser für Antikörperfärbungen der PZM am geeignetsten zu sein scheint. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit erstmals, dass spezifische Organisationsformen superfizieller Chondrozyten mit spezifischen MMP- und Col6A3-Expressionsprofilen assoziiert waren, und dass die mRNA von MMP-2, -9 und -3 im humanen Gelenkknorpel exprimiert wird. Dies kann als ein erster Hinweis darauf gedeutet werden, dass der strukturelle Verlust der PZM mit fortschreitender OA möglicherweise mit einer Typ VI Kollagen-Spaltung zusammenhängt. Dies sollte aber durch Folgestudien kausal bestätigt werde