Genetic transformation and variability detected by RAPD in endophytic isolates of Colletotrichum musae

Colletotrichum é um dos mais importantes gêneros de fungos fitopatogênicos, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais. Espécies de Colletotrichum causam uma série de doenças nas plantas, sendo a antracnose a mais importante delas. No passado, a ausência de relatos sobre o ciclo sexual e a análise de mutações limitaram severamente o entendimento do processo patogênico destes e de muitos outros fungos filamentosos, porém com o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular novas possibilidades surgiram. A transformação genética, por permitir a transferência de genes, tem se tomado um importante recurso para o entendimento da base genética da patogenicidade. Com este objetivo, isolados endofíticos de C. musae foram avaliados quanto à sensibilidade ao benomil e transformados com o gene heterólogo tub2 de Neurospora crassa, presente no plasmídio pBT6. Condições para a obtenção e a regeneração de protoplastos foram estabelecidas, sendo KCI 0,7 M e sacarose 0,7 M empregados respectivamente, para obtenção e regeneração. A eficiência de transformação não ultrapassou 6 transformantes / µg de DNA, nos cinco métodos estudados. Houve o aparecimento de transformantes morfologicamente idênticos ao selvagem, mas também aqueles com conidiação e crescimento comprometidos. Por terem sido capazes de reinfectar plantas axênicas de banana, pode se dizer que a transformação não alterou genes envolvidos com os mecanismos de patogenicidade. Os estudos de variabilidade, com marcadores RAPD, mostraram uma população geneticamente homogênea, com alto grau de similaridade (média de 65%). Sugerindo que alguns isolados podem pertencer a grupos com compatibilidade vegetativa, sendo esta uma forma de geração de variabilidade. A própria reprodução clonal da bananeira pode contribuir para a distribuição de biótipos, uma vez que os fungos, pela capacidade de infectarem as plantas, acabam sendo propagados com a cultura. Mesmo os isolados fúngicos obtidos a partir de lesões do fruto mostraram, em resultados preliminares, um alto grau de similaridade sugerindo que endofíticos típicos e fitopatogênicos podem se constituir em uma mesma população.Colletotrichum is one of the most important genera of phytopathogenic fungi, especially in tropical and subtropical regions. Colletotrichum species cause many plant diseases, having anthracnose as the most serious of them. In the past, the lack of the sexual cycle and mutation analyses limited the comprehension of pathogenic process of Colletotrichum and other filamentous fungi. The development of molecular biology techniques opened new possibilities up. The genetic transformation, by allowing gene transfers, became one important alternative for the understanding of the genetic bases of pathogenicity. With this aim, endophytic isolates of C. musae were evaluated concerning benomyl sensitivity and after that, transformed with the heterologous gene tub2 from Neurospora crassa, present in the plasmid pBT6. Conditions for protoplasts formation and regeneration were established, using KCI 0.7 M e sucrose 0.7 M as osmotic stabilizers, respectively. The transformation efficiency was not more than 6 transformants / µg of plasmid DNA, as result of the five methods tested. There were transformants morphologically identical to the wild strain, but also some of them with conidiation and growth affected. Reinoculation of axenic banana plants showed that the transformation did not interfer on the genes envolved with the pathogenicity mechanisms. On the other hand, variability studies, with RAPD markers, showed a genetically homogeneous population, with high degree of similarity (65%), suggesting that some isolates may be part of vegetative compatibility groups, being this one way to get variability. The clonal reproduction of banana trees may contribute for biotype distribution, since the fungi due to their capacity of infecting plants, can also be propagated with the banana tissues. Even the fungal isolates obtained from fruit lesions showed, in preliminary results, high degree of similarity, suggesting that typical endophytes and pathogenic fungi can be the same population