Role of STMN1 and MELK in human astrocytoma

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno mais comum e agressivo em adultos e o tratamento padrão consiste em ressecção cirúrgica do tumor, seguida de radiação e quimioterapia com temozolomida. Nosso grupo realizou a análise de genes diferencialmente expressos entre GBM e astrocitoma pilocítico. Um dos genes com expressão aumentada em GBMs foi MELK (maternal embryonic leucine zipper kinase), que codifica uma proteína serina/treonina quinase que desempenha um papel importante na proliferação, ciclo celular, apoptose e oncogênese. Uma análise de células de GBM silenciadas para MELK por siRNA foi realizada para identificar possíveis genes associados à via de MELK. Um dos genes identificado foi STMN1, que codifica estatimina 1 (STMN1), uma proteína citosólica importante que desempenha um papel crítico na mitose regulando a dinâmica dos microtúbulos durante a progressão do ciclo celular e migração. Além disto, STMN1 está também envolvida em outros processos biológicos, como migração e diferenciação, através da fosforilação de quatro serinas. A fosforilação específica de quatro serinas (S16, S25, S38 e S63) provoca a ativação da proteína, enfraquecendo sua ligação às moléculas de tubulina, que se associam. FOXM1, importante fator de transcrição, apontado como regulador na expressão de diversos genes essenciais para a progressão do ciclo celular, inclusive STMN1, também foi alvo do presente estudo. Além disto, FOXM1 é fosforilado por MELK, regulando a mitose. MELK, STMN1 e FOXM ainda estão relacionados com resistência de células tumorais ao tratamento com quimioterapia. O objetivo deste estudo foi analisar os níveis de expressão e correlações de MELK, STMN1 e FOXM1 em nossa coorte astrocitomas de diferentes graus de malignidade. Além disso, esses dados foram validados in silico em coortes maiores do The Cancer Genome Atlas (TCGA). Análises funcionais com silenciamento de MELK e STMN1 foram realizadas com linhagens celulares de GBM. A expressão de MELK foi silenciada com siRNA e foi observada uma diminuição também da expressão de STMN1 e de FOXM1. Os níveis de expressão dos três genes aumentaram conforme a malignidade dos astrocitomas em nossa casuística e na do TCGA. Os níveis de expressão de MELK e STMN1, MELK e FOXM1 e STMN1 e FOXM1 estavam positivamente correlacionados em nossa série GBM, bem como na do TCGA Além disto, os três genes apresentaram maior expressão no subtipo proneural de GBM do que nos subtipos mesequimal e clássico na casuística do TCGA. Células U87MG e A172 silenciadas com siRNA de MELK apresentaram diminuição semelhante na expressão de MELK e de STMN1 (~90%), porém com menor nível de diminuição de FOXM1 (~50%). Foramanalisadas também as serinas fosforiladas de STMN1 após o silenciamento de MELK, e houve diminuição da fosforilação em relação ao controle. Por outro lado, quando a expressão de STMN1 foi silenciada com siRNA, a expressão de MELK não se alterou e a de FOXM1 diminuiu cerca de 40%. As células silenciadas apresentaram uma redução na viabilidade e migração celular. Adicionalmente, os casos de GBM foram divididos com base na expressão de STMN1 alta e baixa. Dos casos com expressão de STMN1 aumentado, 79% apresentaram expressão de FOXM1 aumentado, contra 25% no grupo de expressão de STMN1 baixo. Entretanto, estes grupos não apresentaram diferença de sobrevida dos pacientes. A relação entre os três genes e resistência a drogas foi analisada em linhagens U87MG e T98G resistentes a temozolamida e vincristina. Houve um aumento da expressão de STMN1, FOXM1 e MELK nas ambas linhagens quando comparados com o controle das células não resistentes. Os dados sugerem que estes genes estão relacionados a tumorigênese e malignidade dos astrocitomas, bem como a aquisição de resistência a drogas. Outros estudos são necessários para um melhor entendimento destas relaçõesGlioblastoma (GBM) is the most common and aggressive malignant brain tumor in adults and standard treatment consists of surgical resection of the tumor, followed by radiation and chemotherapy with temozolomide. Our group performed the analysis of differently expressed genes between GBM and pilocytic astrocytoma. One of the genes with increased expression in GBMs was MELK (maternal embryonic leucine zipper kinase), which encodes a serine / threonine kinase protein that plays an important role in various cellular processes, such as proliferation, cell cycle, apoptosis, and oncogenesis. A siRNA silenced GBM cell analysis was performed to identify possible genes associated with the MELK pathway. One of the genes identified was STMN1, which encodes stathmin 1, an important cytosolic protein that plays a critical role in mitosis by regulating microtubule dynamics during cell cycle progression and migration. In addition, STMN1 is also involved in other biological processes, such as migrating and differentiating, through the phosphorylation of four serines (S16, S25, S38 and S63) triggers protein activation, weakening its binding to tubulin molecules. FOXM1, an important transcription factor, identified as regulator in the expression of several genes essential for cell cycle progression, including STMN1, was also a target of this study. In addition, FOXM1 is phosphorylated by MELK, regulating mitosis. MELK, STMN1 and FOXM1 are still related to tumor cell resistance to chemotherapy treatment. The aim of this study was to analysize expression levels of MELK, STMN1 and FOXM1 in our cohort astrocytomas of different degrees of malignancy. In addition, these data were validated in silico in larger cohorts of The Cancer Genome Atlas (TCGA). The expression of the three genes increased according to the malignancy of astrocytomas in our cases and in TCGA cases. MELK and STMN1, MELK and FOXM1 and STMN1 and FOXM1 expression levels were positively correlated in our GBM series, as well as in the TCGA series. In addition, the three genes showed higher expression in the proneural GBM subtype than in the Mesenquimal and Clássico subtypes in the case series of TCGA. U87MG and A172 cells silenced with MELK siRNA showed a similar decrease in MELK and STMN1 expression (~90%), but with a lower level of FOXM1 decrease (~50%). Phosphorylated serines of STMN1 were also analyzed after MELK silencing, and there was a decrease in phosphorylation compared to the control. On the other hand, when STMN1 expression was silenced with siRNA, MELK expression did not change and FOXM1 expression decreased by 40%. Silenced cells showed a reduction in cell viability and migration. Additionally, GBM cases were divided based on the expression of high and low STMN1. Of the cases with increased STMN1 expression, 79% showed increased FOXM1 expression, compared to 25% in the low STMN1 expression group. However, these groups showed no difference in survival of patients. The relationship between the three genes and drug resistance was analyzed in temozolamide and vincristine resistant U87MG and T98G cells. There was an increase of STMN1, FOXM1 and MELK expression in both strains when compared to the control of non-resistant cells. The data suggest that these genes are related to astrocytoma tumorigenesis and malignancy, as well as the acquisition of drug resistance. Further studies are needed for a better understanding of these relationship