Exosomes as key players in the paracrine cardioprotective effects of mesenchymal stem cells after acute myocardial infarction

O suprimento inadequado do fluxo sanguíneo para o tecido cardíaco e a morte de cardiomiócitos são eventos importantes na deterioração cardíaca pós-infarto do miocardio (IAM), que associados a baixa capacidade regenerativa dos cardiomiócitos contribuem com as altas estatísticas de morbi-mortalidade associada às doencas cardiovasculares em todo o mundo. O transplante de células estromais do tecido adiposo adulto (ASC) pós-IAM resulta em melhoras estruturais e funcionais decorrentes da diminuição de apoptose em cardiomiócitos, aumento da densidade vascular e redução/modificação da fibrose e da cicatriz. Entretanto, a baixa eficiência da retenção das ASCs transplantadas e a incapacidade de geração de novos cardiomiócitos limitam o efeito das ASCs na regeneração cardíaca, mas ainda assim as ações paracrinas contribuem para a reparação do órgão. Os efetores dessa resposta não foram elucidados e por isso, testamos a hipótese de que exossomos derivados de ASCs contribuem para os efeitos cardioprotetores do transplante de células mesenquimais. Utilizamos as células alvo cardíacas sob condições que mimetizam o microambiente do tecido isquêmico para verificar a hipótese e por fim a validamos no organismo inteiro no modelo de infarto experimental em ratos. Os exossomos derivados de ASC influenciaram processos chave na reparação cardíaca, promoveram a proliferação de cardiomiócitos neonatais (CM) submetidos à hipóxia, além de induz proliferação e potencializar a formação de tubos de células endoteliais microvasculares cardíacas sob normóxia (CMEC). Também modularam o fenótipo de fibroblastos cardíacos submetidos à hipóxia, induzindo redução na proliferação e atenuação da diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos, bem como diminuiu a expressão de colágeno do tipo I e III. Além disto, induziram a diferenciação de macrófagos derivados de medula óssea e o meio condicionado desses macrófagos diferenciados promoveram proliferação nos cardiomiócitos neonatais. Finalmente, validamos o potencial reparativo dos exossomos de ASC in vivo para avaliar o potencial de modular a reparação cardíaca em ratos pós-IAM e observamos inibição da apoptose em cardiomiócitos e espessamento da cicatriz que sugere que a mesma apresenta tecido viável indicando um remodelamento pós o IAM menos acentuado. A fim de entender qual o mecanismo por trás da cardioproteção mediada por exossomos, foi realizado um ensaio de microarranjo de miRNAs dos exossomos extraídos de ASC e utilizando uma abordagem in silico para enriquecimento, selecionamos os microRNAs das famílias miR-199a, miR-146b, miR-425 e miR196a como possíveis mediadores dos efeitos cardioprotetores para serem validados isoladamente e em conjunto futuramente. Em síntese, fornecemos evidências para o papel modulatório dos exossomos na proliferação de células cardíacas e endoteliais, na diferenciação de fibroblastos a miofibroblastos, e na diferenciação de macrófagos que são eventos importantes para o reparo cardíaco e que em muito recapitulam o observado em resposta ao enxerto de ASC. Os dados in vivo corroboram estes achados in vitro e suportam a hipótese de que os exossomos são efetores cardioprotetores da sinalização parácrina de ASCThe inappropriate blood supply to the heart tissue and cardiomyocyte death are important events in cardiac deterioration post-myocardial infarction (AMI), which combined with cardiac myocytes regeneration inability, contribute to the high morbidity and mortality statistics associated with cardiovascular diseases worldwide. Post-myocardial infarction transplantation of adult adipose tissue stromal cells (ASC) results in structural and functional improvements due to decreased apoptosis in cardiomyocytes, increased vascular density and reduced/ modified a fibrotic scar. These effects are mediated by a paracrine effect exerted by ASC in the infarcted myocardium. However, the effectors of this response are yet to be elucidated. Thus, we tested the hypothesis that ASC-derived exosomes contribute to the cardioprotective effects of mesenchymal cell transplantation. To do so, we used cardiac target cells under conditions that mimic the ischemic tissue microenvironment and finally validate the results in the whole organism in the experimental rat infarction model. We found that ASC-derived exosomes influence key processes in cardiac repair, such as proliferation of hypoxia-induced neonatal cardiac myocytes (CM), proliferation, and formation of normoxic cardiac microvascular endothelial cell (CMEC) tubes. They also modulated the phenotype of hypoxia-induced cardiac fibroblasts, attenuating their proliferation and differentiation into myofibroblasts, as well as reduced synthesis of type I and III collagens expression. Additionally, ASC-derived exosomes induced the differentiation of bone marrow-derived macrophages and treatment of neonatal cardiac myocytes with the conditioned media of these differentiated macrophages promoted cell cycle progression. Finally, we validated the reparative potential of ASC exosomes in vivo to assess their potential of modulating cardiac repair in post-AMI rats and observed apoptotic inhibition in cardiac myocytes and presence of viable tissue in a thicker scar when compared to sham, suggesting that treatment with exosomes culminated in a less pronounced post-AMI cardiac remodeling. In order to determine the underlying mechanism of the exosome-associated cardioprotective response, a microarray assay of the exosome-extracted miRNAs from ASC was performed followed by an in silico enrichment approach, through which we selected the miRNA families miR-199a, miR-146b, miR-425 e miR196a as possible mediators of exosome cardioprotection to be validated in future. In synthesis, we provided evidence of a modulatory role of exosomes in the proliferation of cardiac and endothelial cells, fibroblast differentiation to myofibroblasts, and macrophage differentiation, key events taking place during cardiac repair and that recapitulate the observed outcomes in response to ASC graft post-AMI. In vivo data corroborate the in vitro findings and support the hypothesis that exosomes are cardioprotective effectors of the ASC paracrine signalin