Volatile organic compounds as biomarker for infections caused by Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. The establishment of a method to measure volatile organic compounds in the headspace of bacterial cultures and in breath of adult cattle and the investigation of possible influencing factors.

Einleitung Flüchtige organische Substanzen (volatile organic compounds, VOC) werden zunehmend als potentielle diagnostische Marker angesehen. Vor allem für Erkrankungen, bei denen bisherige Diagnostika nicht zufriedenstellend effizient sind, kann die Analyse von VOC über Bakterienkulturen bspw. zur Beschleunigung und Vereinfachung des kulturellen Nachweises beitragen. Aber auch für Krankheitsbilder, für die möglichst nicht-invasive Screeningmethoden gesucht werden, ist die Analyse von VOC im Atemgas oder im Gasraum über nativen Proben (z. B. Kot, Sputum, Harn) sehr vielversprechend. Paratuberkulose betrifft alle Haus- und Wildwiederkäuer und wird durch Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) verursacht. Infizierte Tiere entwickeln eine chronische granulomatöse Enteritis, wobei die Inkubationszeit Jahre umfasst und Symptome, wie intermittierende Diarrhoe und Gewichtsverlust, sehr unspezifisch sind. Aktuell verfügbare diagnostische Methoden sind arbeitsintensiv, langwierig, teuer und unzureichend sensitiv. Aufgrund der hohen Prävalenz von Paratuberkulose in Milchviehherden, ist eine schnelle, nicht-invasive und preiswerte Screeningmethode notwendig. Ziele Das Hauptziel dieser Arbeit war es ein robustes VOC-Profil im Gasraum über MAP-Kulturen zu finden, welches von anderen Mykobakterien-Spezies abgrenzbar ist, und dieses auf relevante Einflussfaktoren, die zu seiner Variabilität beitragen, hin zu untersuchen (in vitro). Ein weiteres Ziel war es einen technischen Aufbau zu etablieren, der es ermöglicht VOC im Atemgas von adulten Rindern unter Feldbedingungen in Echtzeit zu analysieren und diesen Aufbau an Tieren unterschiedlichsten Alters, Körperkondition und Atmungsfrequenzen anzuwenden und mögliche Einflussfaktoren zu definieren (in vivo). Material und Methoden In-vitro-Studien Mithilfe von In-vitro-Studien wurden Spezies-spezifische VOC-Profile erstellt, die im Gasraum über verschiedenen Mykobakterien zu messen sind. Dabei wurden 3 verschiedene MAP-Stämme und 12 weitere Mykobakterien-Spezies (15 verschiedene Stämme) eingesetzt und die Einflussfaktoren Nährmedium, Inkubationszeit und Keimzahl des Inokulates evaluiert. Unter Zuhilfenahme von Daten einer zuvor publizierten Studie wurde ein studienübergreifendes Core-VOC-Profil für MAP definiert und seine Robustheit statistisch analysiert und getestet. In-vivo-Studien Der technische Aufbau zur Atemgasanalyse in Echtzeit wurde an 83 klinisch gesunden adulten Rindern unter Feldbedingungen evaluiert. Physiologische Einflussfaktoren auf das Atemgasprofil, wie Tag, Tageszeit und Adaptation an die Untersuchungsbedingungen, wurden mithilfe einer experimentellen Studie an zwei Jungrindern getestet. Ergebnisse In-vitro-Studien Das Vorkommen von replizierenden Mykobakterien (mit speziellem Hinblick auf MAP) konnte mithilfe der VOC-Analytik im Gasraum der Bakterienkulturen detektiert werden. Vergleichend zu den Substanzkonzentrationen in den Kontrollröhrchen gab es VOC, deren Konzentration über den Bakterienkulturen anstieg und Substanzen, deren Konzentration abfiel. Aus den Ergebnissen von drei Studien konnte ein MAP-assoziiertes Core-VOC-Profil extrahiert werden. Es setzte sich aus 28 Substanzen sechs verschiedener chemischer Stoffklassen zusammen (Aldehyde, Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Furane, Ketone und Ester), die in allen drei Studien jeweils die gleiche Tendenz aufwiesen (Konzentrationsanstieg bzw. –abfall). Die Faktoren Inkubationszeit und Keimzahl des Inokulates haben einen quantitativen Einfluss auf die einzelnen Substanzen des VOC-Profils. Unterschiedliche Nährmedien haben sowohl einen quantitativen als auch einen qualitativen Einfluss. In-vivo-Studien Die methodisch erstmals etablierte Atemgasanalyse in Echtzeit wurde von allen Tieren gut toleriert und war unabhängig der Atmungsfrequenz zuverlässig durchführbar und produzierte vertrauenswürdige Daten. Mithilfe des Online-Messverfahrens konnten sowohl kurz- bis mittelfristige als auch langfristige Änderungen der Substanzkonzentration registriert und getrennt analysiert werden. Dies zeigte sich durch die bei Wiederkäuern physiologisch auftretenden Eruktionen von Pansengas, die zu einem Konzentrationsanstieg der meisten VOC der sich an die Eruktion anschließenden Exspirationen führte. Die VOC unterlagen tageszeitlichen Schwankungen und variierten in ihrer Konzentration auch aufgrund der Messung an unterschiedlichen Tagen. Stress schien auf die Mehrheit von Substanzen einen hohen quantitativen Einfluss zu haben. Schlussfolgerungen In-vitro-Studien Das bakterielle VOC-Profil unterliegt einer Reihe von Einflussfaktoren, die für eine potentielle diagnostische Anwendung zukünftig standardisiert werden müssen. Des Weiteren gibt es Faktoren, wie z. B. Alter oder Charge des Nährmediums, die ebenfalls einen Einfluss haben, allerdings nicht standardisierbar sind. Obwohl die standardisierbaren als auch die nicht standardisierbaren Einflussfaktoren in den drei Studien teilweise Unterschiede aufwiesen, ergaben die beiden statistischen Tests ähnliche Ergebnisse, sodass davon ausgegangen werden kann, dass das studienübergreifende Core-VOC-Profil für MAP robust ist. Mit der Überprüfung dieses MAP-anzeigenden VOC-Profil über nativen Proben (Kot oder Gewebe) und der weiteren Abgrenzung dieses Profils zu anderen Bakterienfamilien wird sich das diagnostische Potential und die damit verbundene Spezifität und Sensitivität der Methode weiter herausstellen. In-vivo-Studien Eine Atemgasanalyse in Echtzeit ist vor allem dann notwendig, wenn kurz- bis mittelfristige Änderungen der Substanzkonzentrationen während der Messung zu erwarten sind. Dies zeigte sich in unseren Untersuchungen durch das Auftreten von Kontaminationen des Atemgases durch Pansengase. Mithilfe des Online-Messverfahrens konnte gezeigt werden, dass die Eruktionen bei Rindern einen quantitativen Einfluss auf die VOC-Konzentrationen in den darauffolgenden Exspirationen haben. Des Weiteren haben die evaluierten Einflüsse von (Tag, Tageszeit und Handling bzw. Stress) gezeigt, dass auch Atemgasmessungen standardisiert werden sollten um reproduzierbare Ergebnisse zu erlangen.Introduction and Objective Volatile organic ompounds (VOC) as potential markers for disease detection have gained increased attention. Especially the analysis of VOC above bacterial cultures is considered as promising approach towards acceleration and simplification of the diagnosis via cultural isolation. On the other hand, the analysis of VOC in breath or above body fluids (such as faeces, sputum or urine) offers the possibility of non-invasive screening methods. Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) causes paratuberculosis, a chronic granulomatous enteritis affecting all ruminants. The symptoms, intermittently appearing diarrhoea and weight loss, are aspecific while incubation takes years. Current available diagnostic methods are very labour intensive, time consuming, expensive and insufficiently sensitive. Also, a rapid, non-invasive and low-priced screening method is needed due to the increasing prevalence of paratuberculosis in dairy cattle and herds. The main goal of this study was to define a robust VOC-profile in the headspace of MAP-cultures, which is definable to other mycobacterial species (in vitro). Also, factors which contribute to the variability of the VOC-profile were investigated. A further aim was to introduce a technical set-up for real-time breath analysis in adult cattle (in vivo). Applicability of the system to conscious cattle of different age and with variable body condition and respiratory rates as well as the reliability of the signals obtained under field conditions were to be tested. Animals, material and methods In-vitro-studies By means of different in-vitro-studies species-specific VOC-profiles were measured in the headspace of different mycobacteria. Three different MAP-strains and twelve further mycobacterial species (15 different strains) were investigated, and the influencing factors (i. e. culture medium, duration of incubation and microbial count of the inoculum) were evaluated. A MAP-associated core-VOC-profile was defined based on data of a previously published study and was comparatively analysed with two approaches to ensure statistical robustness consisting of a set-based intersection analysis and a meta-statistical analysis. In-vivo-studies The technical set-up for breath analysis in real-time was applied under filed conditions to 83 clinically healthy adult cattle. Physiological influencing factors, such as day, time of day and handling of the animals, were tested by means of an experimental study on two calves. Results In-vitro-studies The presence of replicating mycobacteria, with special regard to MAP, could be detected by means of VOC-analysis in the headspace of bacterial cultures. The concentration of the substances above bacterial cultures either increased or decreased compared to pure media vials (control vials). Taking data of three independent studies into account a MAP-associated core-VOC-profile could be extracted. The core-VOC-profile contained 28 substances from six different chemical classes (aldehydes, hydrocarbons, alcohols, furans, ketones and ester), which performed identically in all three studies (increase or decrease of concentration). The two factors duration of incubation and bacterial count of the inoculum influenced the single substances of the VOC-profile quantitatively while differing culture media affected the profile both quantitatively and qualitatively. In-vivo-studies The breath analysis in real-time was well tolerated by each of the cows and produced consistent data sets throughout varying respiratory rates. Both short-term, medium-term and long-term changes could be detected by means of online breath analysis and could be analysed separately from each other. This was shown via physiologically occurring eructations of ruminal gases of ruminants, which led to increased substance concentrations in the subsequent expirations. Variations of substance concentrations showed a sensitivity to measurements taken on different days or at different times of the day. Adaptation to the procedure seemed to have a substantial impact and influenced substances quantitatively. Conclusions In-vitro-studies The bacterial VOC-profile may vary due to a number of influencing factors that need to be standardised for a potential diagnostic approach. Further factors, such as age or batch of the culture media have an impact and cannot be standardised. Even though the three individual studies were carried out with slight differences in methodology, the robustness of the defined core-volatome is justified by the outcome of a two-step statistical analysis of data consisting of a set-based intersection analysis and a meta-statistical analysis. To prove the diagnostic potential of the MAP-associated core-VOC-profile and therefore specificity and sensitivity of the method VOC need to be analysed in field samples (faeces and tissue). Also the profile needs to be evaluated with respect to possible overlapping VOC from other bacteria. In-vivo-studies A breath analysis in real-time is especially necessary for measurements with expected short and medium-term changes in substance concentration. This was shown due to the occurrence of contaminations of the measurements by ruminal gases. By means of the online-analysis of breath we recognised the quantitative impact of eructations of cattle on the concentrations of VOC in subsequent expirations. Further influencing factors (i. e. day, time of day and training) stress the importance of standardised protocols for breath analysis to achieve repeatable results in conscious animals