Culture systems of cells, tissues and organs of Arabidopsis thaliana (Linné) Heynhold in vitro

Arabidopsis thaliana tem sido utilizada como planta modelo para estudos nas genéticas clássica e molecular. Várias das técnicas utilizadas na genética molecular dependem de um sistema para transferência de genes, que em muitos dos casos se baseiam em cultura de tecidos. Um dos ecótipos mais utilizados em estudos de biologia molecular. Landsberg erecta, é um dos que se apresentam mais recalcitrantes quando cultivados in vitro. Neste trabalho são apresentadas metodologias desenvolvidas especificamente para o ecótipo Landsberg erecta, no tocante ao cultivo de plantas, células em suspensão e a organogênese de células, órgãos e tecidos cultivados. O trabalho teve início com o cultivo de plantas em condições de casa de vegetação e in vitro. Duas técnicas de cultivo de plantas em casa de vegetação foram desenvolvidas, uma de semeadura definitiva em vasos e outra com pré- cultura em placas de Petri mantidas em câmara de crescimento. seguida de transplante e desenvolvimento em casa de vegetação. No tocante à cultura in vitro de plantas foram estudados os efeitos de oito agentes gelificantes (Agar. Bacto Agar. Agaroses 1 e 5, Phytagel, Gelrite, Seaplaque e Amido) e a otimização da troca gasosa, indicando que a tradicional cultura de plantas em meio gelificado com agar pode ser substituída com grandes vantagens por produtos alternativos, tanto em termos de produção de biomassa. como qualidade de plantas. A combinação de frasco aerado contendo meio com amido aumentou a massa de matéria seca em mais de 3 vezes para parte aérea e em mais de 10 vezes a raiz. quando comparado com meio gelificado com agar. O uso de filtros de espuma melhorou a troca gasosa e permitiu a produção de sementes in vitro, além de produzir plantas mais saudáveis, excelentes fontes de explantes. Das plantas cultivadas in vitro foram retirados explantes para outros estudos. Conseguiu-se regeneração de explantes cultivados de folha e de raiz. Através do uso de um meio original na organogênese de tecidos de Arabidopsis thaliana conseguiu-se reduzir o tempo de regeneração de plantas intactas férteis para apenas 60 dias, computados desde a inoculação do explante de raiz até a produção de sementes. Suspensões celulares foram estabelecidas a partir de plântula inteira, folha ou raiz, sendo que esta última foi a que produziu maior biomassa independentemente dos meios e temperaturas de cultivo utilizados. Tais suspensões celulares foram cultivadas em temperaturas que variaram de 22 a 30°C, encontrando-se como mais conveniente a de 26°C. Entre os quatro meios de cultura testados, dois foram selecionados, um contendo baixo teor de 2,4-D (0.2mg/l) e outro com teor de 2mg/l. Quanto à organogênese a partir de células cultivadas de raiz, observou-se que os meios contendo Thidiazuron, apesar de propiciarem regeneração de plantas em grande profusão, estas não produziram sementes. Por outro lado, meio contendo isopentenil adenina foi o que melhor aliou produtividade e fertilidade de regenerantes, não apresentando maiores dificuldades para a obtenção de plantas intactas, com sementes. Dentre os outros parâmetros estudados que estimularam a organogênese de células cultivadas encontra-se: o tamanho e quantidade de agregados celulares plaqueados; a pré-incubação desses agregados em meio de formação de calos por 7 dias; incubação a 4°C por 24 horas, no escuro, logo após a transferência ao meio de regeneração. O emprego de carbono ativado neutralizado, por sua vez, reduziu o escurecimento de brotos regenerados e o uso de filtros de espuma nos frascos de cultura, contribuiu, também neste caso, para que os regenerantes produzissem sementesFor the past few years Arabidopsis thaliana has been used as a model plant for studies in classic and molecular genetics. Many of the techniques employed in molecular genetics depend on a gene transfer system which is mostly based on tissue culture. Although Landsberg erecta is one of the most largely used ecotypes in such studies it is also known as one of the most recalcitrant for in vitro culture. In order to achieve the aim of obtaining fertile plants through the organogenesis of culture cells and tissues it was first necessary to develop protocols for the growth of plants in both glasshouse and in vitro conditions. Two ways for achieving the growth of plants in a glasshouse were developed. Firstly, by direct sowing in a glasshouse and secondly, by pre-culture, under artificial conditions, in a growth room, with a subsequent transfer to a glasshouse to complete their development. The effects of eight gelling agents (Agar, Bacto Agar, Agaroses 1 and 5, Phytagel, Gelrite, Seaplaque and a starch mixture) and gaseous exchange on in vitro growth of plants were also investigated. The traditional method of growing plants on Agar was substituted with alternative products producing advantages in terms of both biomass production and costs. A 3-fold and 10-fold increase in the dry weight of aerial parts and roots was produced by a combination of aerated vessels containing Agar-gelled media. It was also shown that the use of cylindrical foam bung filters improved the gaseous exchange leading to the production of healthier plants, a good source of explants, and allowing the setting of seeds. thereby completing their cycle in vitro. Excised from that in vitro cultured material were the explants for the organogenesis of tissues. The regeneration of fertile plants from leaf and root explants was then observed. By employing an original and simple regeneration medium in Arabidopsis tissue culture a time of only 60 days between the inoculation of root explants and the production of seeds was made possible. From the same in vitro grown plants cell suspensions were established using either plantlet, leaf or root explants, where the latter of the three was found to be superior in terms of biomass production regardless of the type of culture media or temperature levels. Cell suspensions were cultured without light at between 22 and 30°C. The most suitable temperature being 26°C. Of the four tested media two were selected. one containing low contents of 2,4-D (0.2mg/l) and the other with ten times that amount. Organogenesis was then successfully achieved from those cultured cells. Although media containing Thidiazuron induced a large amount of shoots, seed setting was not observed when that growth regulator was employed. Thus, if fertile plants with seeds were not the main aim, then Thidiazuron would be a suitable option. On the other hand IPA proved itself to be superior as a growth regulator for shoot induction and did not inhibit seed production, leading to normal looking plants. Other observations included the enhancement of organogenesis by a 7 day pre-incubation period on callus inducing medium prior to their transfer to shoot inducing medium. Also observed were the effects of cold treatment for 24h at 4°C without light for the first day of usage of shoot inducing medium. It was also found that neutralized activated charcoal was effective in reducing the browning of newly regenerated shoots, and the use of foam bung filters promoted normal flowering and consequently seed setting by the regenerant