The use of immobilized Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae cells for starch saccharification ano simultaneous continuous alcoholic fermentation

O trabalho inquirido acerca da utilização de células imobilizadas de Bacillus subtilis e Saccharomyces cerevisiae no processo simultâneo de sacarificação e fermentação alcoólica contínua foi conduzido através da escolha de um suporte alternativo, para a fixação das células microbianas, por adsorção e pelo emprego de reatores cilíndricos dispostos horizontalmente. A verificação da potencialidade do suporte e o estabelecimento de parâmetros para o processo contínuo, foram feitos através de experimento semi-contínuo. O suporte, carvão mineral poroso com densidade 1600g/l, foi imerso em água por 24h, seco a 105°C por 6h e fragmentado em unidades com 10mm de diâmetro. A seguir, foi lavado com solução tampão fosfato 0,2M, pH 7,8, tratado a 500°C por 6h e esterilizado a 121°C por 15min antes do contato com as células dos microorganismos. Observado através de microscopia eletrônica de varredura, permitiu 90% de eficiência de imobilização, apresentando as características de ser resistente e reutilizável. A imobilização das células do B. subtilis, foi feita após crescimento por 17h e com uma população da ordem de 3 X 106 UFC/ml; após centrifugação (550G por 30min) as células foram recolhidas em tampão fosfato 0,2M, pH 7,0. Nova centrifugação foi realizada nas mesmas condições e as células recolhidas em tampão fosfato foram colocadas em contato com o suporte por 3h em agitador a 35°C. A quantidade de células imobilizadas foi de 2,7 x 106 UFC/ml. A imobilização das células da S. cerevisiae, foi feita após crescimento por 24h e com uma população da ordem de 9 X 107 células/ml; após centrifugação (550G por 15 min) as células foram recolhidas em tampão citrato-fosfato (CPB) 0,05M, pH 3,5. Nova centrifugação foi realizada nas mesmas condições e as células recolhidas em CPB foram colocadas em contato com o suporte por 3h em agitador a 35°C. A quantidade de células imobilizadas foi de 8,1 X 107 células/ml. Os reatores cilíndricos construídos em vidro e acrílico, com dimensões de 86,0 X 8,0cm e volume de 4,32 l foram projetados com orifícios a cada 12 cm, para permitir o escape de CO2. A temperatura foi controlada por banho termostático regulado a 35°C. Os reatores foram acoplados e dispostos horizontalmente, ligeiramente inclinados, com vazão de alimentação controlada por meio de bomba peristáltica. O efluente foi recolhido por gravidade, na saída do reator 2, em frasco erlenmeyer. Os meios de alimentação denominados meio modificado com amido irradiado MMAI 1% e 3%, foram compostos de peptona, triptona, extrato de levedura, amido solúvel irradiado (25 kGy) e sais minerais ajustados a pH 6,8. O acompanhamento das fermentações foi feito através das análises de amido, açúcares redutores, glicose e teor alcóolico. O experimento semi-contínuo utilizando meio com 1% de amido, operou por 238h, Qal 16,37ml/h, θ 48,8h e D 0,02h-1, com efetiva conversão do amido de 87,51% e produção média de 2,0g/l de AR. Com meio a 9% de glicose e utilizando meio bioconvertido, operou por 214h, a Qal 16,6ml/h, θ 54,2h e D 0,02h-1, com a produção média de 8,82g/l de álcool. O processo contínuo operou satisfatoriamente por 550h, a Qal 62,5 ml/h, θ 35,2h e D 0,03h-1. Em meio com 1% de amido, a conversão média do amido foi de 86,0% em AR de 8,72% e em glicose de 2,44%. Em meio de 3% de amido, a conversão média do amido foi de 81,6%, em AR de 10,62% e em glicose de 3%. O rendimento em álcool foi de 93,9% às 84h e 74,4% nas 134h subsequentes; chegando a 100% até as 442h, período este referente a fermentação do meio bioconvertido a partir de 3% de amido. As produções médias de álcool, considerando os períodos acima, foram de 2.30g/l, 1,80g/l e 2,90g/l e as produtividades médias de 0,20, 0,13 e 0,27g/l.h-1. Pode-se ressaltar como pontos favoráveis desta pesquisa (1) a condução do processo a temperaturas baixas, da ordem de 35°C, (2) utilização de suporte de alta eficiência para a imobilização, resistente e reutilizável, (3) reatores acoplados permitindo a ação independente das enzimas em cada substrato e (4) reatores dispostos de forma a facilitar a remoção de produtos inibitórios finais.This work deals with the use of immobilized Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae cells for starch saccharification and simultaneous continuous alcoholic fermentation process. It was carried out choosing an alternative support for fixing the microbial cells by adsorption and by the use of cilyndrical reactors set horizontally. The support as potential checking and parameters setting for the continuous process were carriedout in a semi-continuous experiment. The support, a porous mineral coal showing a density of 1,600 grams per liter, was immersed for 24 hours in tap water, dried for 24 hours at 105°C, and fragmented to pieces of 10mm diameter. Then, the pieces were washed in phosphate buffer 0.2M, pH 7.8 for 6 hours at 500°C and sterilized for 15 minutes at 121°C before contact with microorganism cells. It was observed by scanning electron microscopy to show 90% of immobilization in efficiency, presenting resilience characteristics for the reutilization. The Bacillus subtilis cells immobilization were carried out after growing them for 17 hours with a population of about 3 x 106 CFU/mL; after the centrifugation (550G for 30 min) the cells were placed in phosphate buffer 0.2M, pH 7.0. Another centrifugation was carried out at the same conditions and the cells put in phosphate buffercontacting the support for 3 hours in a agitador at 35°C. The amount of immobilized cells were 2.7 x 106 CFU/mL. The Saccharomyces cerevisiae cells immobilization were carried out after growing them for 24 hours with a population of about 9 x 107 cells/mL; after the centrifugation (550G for 15 min) the cells were placed in citrate phosphate buffer CPB 0.05M, pH 3.5. Another centrifugation was carried out at the same condition and the cells put in CPB contacting the support for 3 hours in a agitador at 35°C. The amount of immobilized cells were 8.1 x 107 cells/mL. The cylinder reactors, built in glass and acrylic, size 86.0 x 8.0cm and volume 4.32 L were designed with holes each 12cm apart to allow CO2 release. The temperature was controlled by a thermostatic bath remaining at 35°C. The reactors were coupled horizontally, slightly inclined, with a flow rate controlled by a peristaltic pump. The effluent was collected by gravity at the way out of reactor 2 in erlenmeyer flasks. The feedstocks called modified irradiated starch medium - MISM 1% and 3% were prepared using peptone, tryptone, yeast extract, irradiated soluble starch (25kGy) and mineral salts and ajusted to pH 6.8. The fermentation monitoring was carried out by starch, reducing sugars, glucose and alcohol analyses. The semi-continuous experiment using the feedstock with 1% starch, worked for 238h, with a flow rate 16.37ml per hour, 48.8h residence time and 0.02h-1 dilution rate, had an effective starch conversion of 87.51% and an average of reducing sugars of 2g/L. Having a medium of 9% of glucose and using a bioconverted medium, it worked for 214h, with a flow rate of 16.6mL/h, 54.2h residence time and 0.02h-1 dilution rate, with an average alcohol production rate of 8.82g/L. The continuous process worked satisfactorally for 550h, 62.5SmL/h flow rate, 35.2h residence time and 0,03h-1 dilution rate. In a 1% starch medium, the average total conversion of starch was 86%; being 8.72% to reducing sugars 8.72% and 2.44% to glucose. In a 3% starch medium, the average total conversion of starch was 81.6%; being 10.72% to reducing sugars and 3% to glucose. The alcohol yield at 84h was 93.9% and in the following 134 hours was 74.4%, reaching 100% at 442h. These times refer to the bioconverted medium starting from 3% starch. The average alcohol production considering the timing above was 2.30, 1.80 and 2.90g/L and the average productivity was 0.20, 0.13 and 0.27g/L.h-1. Favorable points can be enhanced in this research (1) to carry out the process at low temperatures, around 35°C; (2) the use of high efficiency support for the immobilization, resilient and reusable; (3) coupled reactors allowing an independent enzyme action in each substrate and (4) reactors setting in a way to make easier the final removal of inhibitory by-products