Etude des voies de signalisation associées aux effets du peptide vasoactif urotensine II sur la migration et l'adhésion des cellules tumorales gliales

Chemotaxis is a guiding mechanism including a first processing phase through diffusionof a gradient concentration of specific mediators, and a second detection phase of thischemical gradient (defined as a chemoattractant or chemorepellant signal), by cell ororganisms, and the adaptation of the movement direction. Although chemotaxis anddirectional migration finally represent universal mechanisms, and that detailed involvedprocesses are widely studied, they constitute a major challenge for research exhibiting anumber of physiopathological applications from embryogenesis, tissue repair andregeneration, inflammation to cancer.The development of cerebral glial tumors required specific features as tumoral cellinvasion, neoangiogenesis and chemoattraction of proangiogenic macrophage cells. Despiteintense research in neuro-oncology, the survival median of patients with high-grade tumorssuch as glioblastoma is only 15 months. Thus, G protein-coupled receptors (GPCRs) and theirligands expressed in glioblastoma and relaying effects on migration, invasion andangiogenesis, represent potential therapeutic targets. GPCRs are indeed able to recruitheterotrimeric G proteins and tyrosine kinase receptors (RTKs) likely through the formationof macromolecular complexes involving GPCR C-terminal cytosolic domains. Among majorchemotaxis players, GPCR ligands, i.e. chemokines, lipids and vasoactive peptides, stimulatemigration/invasion of various cell types, including tumor cells.Urotensin II (UII) and its paralog urotensin II-related peptide (URP) are the endogenousligands of a GPCR named UT and are considered as most potent vasoactive factorscharacterized to date. The work performed in the team had previously shown the expressionof UT in rat cortical astrocytes, in human astrocytes and in a high grade glioma cell line, and aspecific role of UII in astrocyte proliferation/survival. These data suggested that theurotensinergic system would play a major role in astrocyte activity in physiological andpathophysiological conditions, and contribute to the development of high grade glioma.In this context, the aim of my thesis work was to determine the role of the urotensinergicsystem in the development of brain tumors of glial origin through in vitro investigation ofsignaling events relayed by UT. This research project aimed to i) investigate urotensinergicsystem expression in glioma, determine the effects of UII on proliferation, migration andadhesion of glial tumor cells and characterize the signaling pathways involved in these effectsusing pharmacological and molecular tools, ii) identify, by using two-hybrid strategy, proteinpartners of the C-terminal cytosolic domain of UT, potentially involved in transductionpathways activated by UII and iii) identify by means of a phosphoproteomics approach, a setof proteins phosphorylated and dephosphorylated in a glioblastoma cell line exposed to theUII peptide.In the first part of my work, we showed the expression of UT and UII in humanastrocytoma and glioblastoma cell lines, in tumor explants from patients as well as inglioblastoma tissue sections obtained in collaboration with the anatomocytopathologydepartment of the Rouen University Hospital. In fresh glioblastoma tumor explants andglioma cell lines, we demonstrated that UT was not coupled to the classical IP3/Ca2+pathwayang failed to modify proliferation, cell cycle progression as wel as ERK1/2 and AKTpathways. We have established for the first time that a gradient of low UII concentrationinduced chemotaxic migration of glioma cells. This effect was concentration-dependent andblocked by peptidic (urantide) and non-peptidic (palosuran) UT antagonists. Pharmacologicalagents, i.e. Gi/o (PTX), PI3K (LY294002), and ROCK (Y27632) inhibitors, and moleculartools (UT mutated in the G protein interacting motif ERY or siRNA anti Gα13), highlightedthat UII-mediating migration is mainly relayed by the G13/Rho/ROCK cascade but alsoinvolved the Gi/o/PI3K pathway. Conversely, a high homogeneous concentration of UIIinhibited cell motility and stimulated cell-matrix adhesions likely through actinpolymerization, formation and maturation of focal adhesions. Glioma cell-matrix adhesionwas shown to be mainly mediated by Gi/o and partially involved PI3K. In conclusion, theseresults suggest that UT behaves like a professional chemotaxic receptor activating a signalingswitch between the directional cell migration and adhesion in response to a gradient or auniform concentration of UII respectively and thus should play a role during high-gradeglioma development.In the second part of this work, by means of the two-hybrid system, we aimed tocharacterize protein partners of the UT C-terminal domain. Thus, we identified 8 proteinsincluding filamin A, an actin binding protein classically known to be involved in celladhesion and migration. We showed that this large and multidomain protein interacted withthe 332-351 C-terminal fragment of the human UT, through its 16 to 19 domains. Weobtained some encouraging data confirming the interaction between UT and filamin A byGST-pull down, but our co-immunoprecipitation and bioluminescence resonance energytransfer (BRET) experiments have to be reproduced with modifications in the strategy. Byusing cell lines deficient for filamin A (M2) or stably expressing filamin A (A7), wedetermined that this multifunctional protein is important for the dimerization of UT and thesubcellular localization of the receptor. By immunocytochemistry, we observed that UT iscolocalized with filamin A at the lamellipodia in A7 cells, or is mainly localized at the plasmamembrane in M2 cells. After exposure to the agonist, UT appeared translocated to the plasmamembrane in A7 whereas internalized (punctiform cytoplasmic labeling) in M2 cells. In bothcell types (M2 and A7), UII stimulated cell migration and actin polymerization with a morepronounced effect on cells lacking filamin A. By flow cytometry and immunocytochemistry,we finally detected high filamin A expression in glioma cell lines U87 and SW1088 and inglioblastoma explants from patients. In these tumor cells, filamin A was colocalized with UTin protrusions and in cells exhibiting a fusiform morphology, and UII led to thedephosphorylation (Ser 2151) and cleavage of filamin A. Taken together, these results suggestthat filamin A favors the formation of oligomeric structures, the cytosolic localization of UT,the translocation of UT at the plasma membrane and plays a role in cell migration. Onehypothesis is that translocation of UT oligomers to the plasma membrane maybe subsequentto the activation of a subpopulation of mobile membrane UT, relays within lipid rafts,signaling pathways of cell adhesion.To identify the cellular actors of migration and adhesion, effectors of the urotensinergicsystem, we conducted a phosphoproteomics analysis of glioma cell line U87 in the absence orthe presence of UII. This study, conducted in collaboration with the Proteomic platformPISSARO (Philipe Chan, Pascal Cosette, Julie Hardouin, Antoine Obry) allowed us toidentify 13 and 32 proteins whose levels of phosphorylation and dephosphorylation wereincreased. Among them, 13 including filamin A, filamin C, LIMK or talin are involved in cellmigration and/or adhesion. Validation by Western blot and the more detailed study of theidentified proteins, will allow us to better understand the complexity of UT signalingpathways relaying mechanisms of migration and adhesion.Thus, we aim to initiate the development of urotensinergic ligands that would only activateadhesion pathways of glial tumor cells. Such ligands, promoting cell-matrix and cell-celladhesions would confine the tumor mass by inhibiting invasion, neoangiogenesis, andchemoattraction of proangiogenic macrophages.Le chimiotactisme est un mécanisme de guidage comprenant une première étape degénération par diffusion d'un gradient de concentration d'un médiateur spécifique, unedeuxième étape de détection de ce gradient chimique (étant défini comme chimio-attractantou chimio-repoussant) par les cellules ou organismes, et une troisième étape de modificationde la direction du déplacement. Bien que le chimiotactisme et la migration directionnellereprésentent un mécanisme universel et que les processus impliqués soient très étudiés, ilsconstituent un enjeu majeur de recherche dont les applications s’étendent à l’embryogenèse, laréparation et la régénération tissulaire, la réponse inflammatoire mais aussi au cancer.Le développement des tumeurs cérébrales d’origine gliale s’accompagne de mécanismesinvasifs, néoangiogéniques, et de chimioattraction de cellules macrophagiques proangiogéniques.En dépit des progrès réalisés en neurooncologie, les patients atteints detumeurs de haut grade telles que les glioblastomes, présentent une médiane de survie deseulement 15 mois. Ainsi, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) et leurs ligandsexprimés dans les glioblastomes et relayant des effets sur la migration, l’invasion et lanéoangiogenèse représentent des cibles thérapeutiques potentielles. Les RCPGs sont en effetcapables de recruter certaines protéines G hétérotrimériques, ainsi que des récepteurs tyrosinekinase (RTKs) via notamment la formation de complexes macromoléculaires au niveau deleurs domaines C-terminal cytosoliques. Parmi les principaux acteurs du chimiotactisme, lesligands de RCPGs, i.e. chimiokines, lipides et peptides vasoactifs, stimulent lamigration/invasion de divers types cellulaires et notamment des cellules cancéreuses.L’urotensine II (UII) et son paralogue l’urotensin II-related peptide (URP) sont les ligandsendogènes d’un RCPG nommé UT et sont considérés comme les facteurs vasoactifs les pluspuissants caractérisés à ce jour. Les travaux réalisés dans l’équipe ont précédemment mis enévidence l’expression de l’UT dans les astrocytes corticaux de Rat en culture, dans desastrocytes humains et dans une lignée de gliome de haut grade, ainsi que le rôle spécifique del’UII sur la prolifération/survie des astrocytes. Ces données suggèrent que le systèmeurotensinergique joue un rôle majeur dans l’activité des astrocytes en conditionsphysiologique et physiopathologique, et contribuerait au développement des gliomes de hautgrade.Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse visait donc à déterminer le rôle dusystème urotensinergique dans le développement des tumeurs cérébrales d’origine gliale, parune analyse des mécanismes de signalisation relayés par l’UT in vitro. Ce projet de recherchea consisté à i) rechercher l’expression du système urotensinergique dans les gliomes,déterminer les effets de l’UII sur la prolifération, la migration et l’adhésion des cellulestumorales gliales et caractériser les voies de signalisation impliquées dans ces effets à l’aided’outils pharmacologiques et moléculaires, ii) identifier par double-hybride des partenairesprotéiques du domaine C-terminal cytosolique de l’UT, potentiellement impliqués dans lesvoies de signalisation activées par l’UII et iii) rechercher, par une approchephosphoprotéomique, un ensemble de protéines phosphorylées et déphosphorylées dans unelignée de glioblastome exposée au peptide UII.Dans la première partie de mes travaux, nous avons montré l’expression de l’UT et del’UII dans des lignées humaines d’astrocytomes et de glioblastomes, dans des explantstumoraux issus de patient ainsi que dans des sections de glioblastome obtenues encollaboration avec le service d’anatomopathologie du CHU de Rouen. Sur les lignéestumorales gliales et des explants tumoraux, nous avons démontré que l’UT n’est pas couplé àla voie classique IP3/Ca2+, ne modifie pas la prolifération, la progression du cycle cellulaire, etn’active pas les voies ERK1/2 et AKT. Nous avons établi pour la première fois qu’un gradientd’UII induit la migration cellulaire chimiotactique des gliomes. Cet effet est concentrationdépendantet est bloqué par les antagonistes peptidique (urantide) et non peptidique(palosuran) de l’UII. Des outils pharmacologiques, i.e. des inhibiteurs de Gi/o (PTX), de PI3K(LY294002) et de ROCK (Y27632), et moléculaires (UT muté sur le domaine ERYd’interaction aux protéines G et siRNA anti Gα13), nous ont permis de déterminer que leseffets de l’UII sur la migration sont principalement relayés par la voie G13/Rho/ROCK et quela voie Gi/o/PI3K est également impliquée. A l’inverse, une forte concentration homogèned’UII inhibe la motilité cellulaire et stimule les adhésions cellule-matrice et provoque lapolymérisation d’actine, la formation et la maturation d’adhésions focales. Le processusd’adhésion cellule-matrice est dépendant de l’interaction de l’UT à la protéine Gi/o et impliqueen partie la PI3K. En conclusion, ces résultats suggèrent que l’UT se comporte comme unrécepteur chimiotactique professionnel relayant les changements de signalisation entre lamigration directionnelle et l’adhésion cellulaire en réponse à un gradient ou à uneconcentration homogène d’UII respectivement, et pourrait participer au développement desgliomes de haut grade.Dans la deuxième partie de mes travaux de thèse, nous avons recherché par double-hybrideles partenaires protéiques du domaine C-terminal de l’UT et identifié 8 protéines dont lafilamine A, une protéine de liaison à l’actine impliquée dans les processus de migration etd’adhésion cellulaires. Nous avons déterminé que cette protéine via ses domaines 16 à 19interagit avec le fragment 332-351 de l’UT humain. Bien qu’encourageantes, les tentatives deconfirmation de l’interaction entre l’UT et la filamine A par GST-pull down oubioluminescence resonance energy transfer (BRET) seront encore à mettre au point. Grâceaux lignées déficientes en filamine A (M2) et exprimant stablement la filamine A (A7), nousavons déterminé que cette protéine présentant de multiples domaines d’intérêt, est importantepour la dimérisation de l’UT et la localisation subcellulaire du récepteur. Des étudesd’immunocytochimie ont révélé que l’UT est colocalisé avec la filamine A au niveau deslamellipodes dans les cellules A7, ou bien se trouve principalement localisé à la membraneplasmique dans les cellules M2. Après exposition à l’agoniste, l’UT semble transporté à lamembrane plasmique des cellules A7, tandis qu’il est internalisé (marquage ponctiformecytoplasmique) dans les cellules M2. Sur les deux types cellulaires (M2 et A7), l’UII stimulela migration cellulaire et la polymérisation d’actine avec un effet plus prononcé sur lescellules déficientes en filamine A. Par cytométrie en flux et immunocytochimie, nous avonsmontré que la filamine A est hautement exprimée dans les lignées de gliomes SW1088 et U87et dans des explants de glioblastome issus de patients et qu’elle est colocalisée avec l’UT dansdes protrusions et dans des cellules de morphologie fusiforme. Dans une lignée de gliome,l’UII entraîne la déphosphorylation de la filamine A (Ser 2151) et son clivage. L’ensemble deces résultats suggère que la filamine A favorise la formation de dimères, la localisationprincipalement cytosolique de l’UT, est clivée après traitement UII, et participe à la migrationcellulaire. Une des hypothèses est que la translocation de dimères d’UT à la membraneplasmique, consécutive à l’activation d’une population de récepteurs membranaires mobiles,relayerait, au sein de radeaux lipidiques, les voies de signalisation de l’adhésion cellulaire.Afin d’identifier les acteurs cellulaires de la migration et de l’adhésion effecteurs dusystème urotensinergique, nous avons réalisé l’analyse phosphoprotéomique de cellules delignée de gliome U87 en présence ou en absence d’UII. Cette étude, réalisée en collaborationavec la plate-forme de protéomique PISSARO (Philipe Chan, Pascal Cosette, Julie Hardouin,Antoine Obry) nous a permis d’identifier 13 et 32 protéines dont les niveaux dephosphorylation et de déphosphorylation sont augmentés, parmi lesquelles 13 sont impliquéesdans la migration et/ou l’adhésion cellulaire dont la filamine A et C, la LIMK et la taline. Lavalidation par Western blot et l’étude plus précise des protéines identifiées nous permettra demieux comprendre la complexité des voies de signalisation de l’UT relayant les mécanismesde migration et d’adhésion.Ainsi, nous envisageons le développement de ligands urotensinergiques qui activeraientuniquement la voie d’adhésion des cellules tumorales gliales. De tels ligands, en favorisant lesadhésions cellule-matrice et cellule-cellule confineraient la masse tumorale en inhibantl’invasion, la néoangiogenèse, et la chimioattraction de macrophages pro-angiogéniques