Implicación de los residuos N404, S405 y T406 del dominio yuxtamembrana extracelular, en el tráfico y activación del receptor de neurotrofinas TrkA

[ES] Las neurotrofinas son unos ligandos solubles implicados en el desarrollo y supervivencia del sistema nervioso, que ejercen su función mediante la unión a receptores de membrana. TrkA es uno de éstos, un receptor tirosina quinasa implicado en el crecimiento y diferenciación de las neuronas nociceptivas, así como en su supervivencia. La activación de TrkA está mediada así, por la unión a la neurotrofina NGF, que produce su dimerización, autofosoforilación y transfosforilación en el dominio tirosina kinasa intracelular. Durante el estudio de la participación de ciertos residuos en la activación de TrkA, se observó que mutaciones en los residuos N404, S405 y T406 del dominio yuxtamembrana extracelular, disminuían la activación de TrkA por NGF. En este trabajo se estudia los mecanismos de tráfico a membrana y de la inactivación de TrkA con las mutaciones N404A, S405A y T406A. Se estudió la capacidad de transporte a membrana de estos mutantes mediante citometría de flujo y ensayos de inmunofluorescencia, completándolo con estudios de la actividad del receptor a través de ensayos de señalización por actividad quinasa mediante Western Blot, en presencia de NGF. Se observó que especialmente el mutante T406A tiene una capacidad reducida para llegar a la membrana. Aunque el sitio N-S-T (404-406) es un sitio de consenso de N-glicosilación, que podría ser responsable de los efectos observados, se vio que la mutación N404A no afecta a la localización de TrkA en la membrana plasmática, sugiriendo que la inactivación de TrkA-T406A no se debe a una falta en la N-glicosilación del residuo N404. Por otra parte, in silico se predijo un posible sitio de O-glicosilación en la posición T406. Para evaluar dicha posibilidad se realizaron ensayos de deglicosilación. Los resultados finalmente llevaron a descartar esta última hipótesis de Oglicosilación. Sin embargo, determinamos que TrkA necesita de la posición T406 para su correcto tránsito desde las membranas intracelulares hasta la membrana plasmática, lo que sugiere la presencia de una importante modificación postraduccional, hasta ahora no descrita en este receptor.[EN] Neurotrophins are soluble ligands implicated in development and survival of the nervous system, working through binding membrane receptors. TrkA is one of these, a tyrosine kinase receptor involved in growth and differentiation of nociceptive neurons, as in their survival. TrkA activation is mediated by NGF neurotrophin binding which leads to dimerization, autophosphorylation and transphosphorylation in the intracellular tyrosine kinase domain. In the study of the role of certain residues in the activation of TrkA, it appeared that mutations in the N404, S405 and T406 residues of the extracellular juxtamembrane domain decreased the activity of TrkA via NGF. This work studies mechanisms of TrkA trafficking and inactivation with N404A, S405A y T406A mutations. Protein trafficking of the receptor in these mutants was studied by flow cytometry and immunofluorescence assays. This was supplemented with activity studies through signalling-kinase activity assays by Western Blot, in the presence of NGF. We observed, especially in the T406A mutant, a reduced ability to reach the membrane, despite the mutation has no effect on activation mechanism of the receptor. Although site N-S-T (404-406) is a N-glycosylation consensus site, that could be responsible of these effects, it was determined that the N404A mutation does not affect TrkA normal location. This suggests that the inactivation of TrkA-T406A is not due to a lack of N-glycan of the N404 residue. Alternatively, a potential O-glycosylation site was predicted in silico at position T406. To evaluate this hypothesis deglycation assays were performed. Results finally led to dismiss this last O-glycosylation hypothesis. However, we determined TrkA needs T406 position for its proper traffic from intracellular membranes to the plasma membrane, suggesting an important post-translational modification, until now unknown in this receptor.Berbegal Sáez, P. (2019). Implicación de los residuos N404, S405 y T406 del dominio yuxtamembrana extracelular, en el tráfico y activación del receptor de neurotrofinas TrkA. http://hdl.handle.net/10251/12474